[发明专利]检测α-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人体内酶含量的检测试剂，尤其涉及一种检测α-L-岩藻糖苷酶的液体单试剂及其制备方法，属于α-L-岩藻糖苷酶的检测领域。

背景技术

α-L-岩藻糖苷酶（α-L-Fucosidase，AFU）是一种溶酶体酸性水解酶，分类名为α-L-岩藻糖苷岩藻糖水解酶（EC3.2.1.51）。它主要存在于人体内的各种组织、细胞及体液中，如肝、胰、脑、肺、肾纤维细胞等的溶酶体内，以肝肾含量最高。在血清、尿液、唾液、泪液和垂体液中均含此酶。基本生理功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖肽、糖蛋白和糖苷的分解代谢。

岩藻糖苷贮积症患者的脑、肝、肾、肺、尿内都有该酶的缺乏，导致在这些器官内出现异常的沉积物。在脑、肝等组织的沉积物是一种含有岩藻糖的糖脂，主要以岩藻糖为终末部分的四己糖基及五己糖基神经酰胺为主，特别是脑内此特征最为明显。因此可能这是岩藻糖苷贮积症的发病机制。本病分幼儿型和成人型，他们有共同的特征如全身肌张力低下、出汗过多、体态短小、进行性智力和运动发育迟缓等。幼儿型一般在一岁左右出现明显临床症状，多死于10岁以内。

α-L-岩藻糖苷酶升高多见于肝脏受损患者、妊娠与卵巢肿瘤等情况。早在1977年，Bauer等就在动物实验中观察到鼠肝癌组织中AFU活力较正常肝脏高7倍，提示AFU可作为一项肝癌非特异性标志物；1980年Deugnier等首先在人肝癌患者血清中发现AFU活性明显高于正常人，正式为诊断原发性肝癌(PHC)提供了新的指标。肝癌患者血清AFU升高的原因目前暂不清楚，可能机制是：①肝癌细胞合成酶增加并大量释放入血。②血清AFU破坏减少，正常时肝枯否细胞从血清中清除AFU，推测肝癌患者由于细胞免疫功能低下或其他原因使枯否细胞清除AFU的能力下降，而表现为酶活性升高。③含岩藻糖的糖蛋白和糖脂的代谢紊乱。

目前临床诊断早期肝癌的主要生化指标是甲胎蛋白（Alpha Fetal Protein，AFP），它是胚胎时期肝细胞合成的一种特殊糖蛋白，可促进胚胎肝组织迅速增殖，故胎血中含量高，在胎儿出生后约1～4周基本消失，成人血中含量非常少。当肝癌组织只有0.1～0.2厘米的癌块时，患者血液中就能检测到AFP的升高，而此时用B 超、CT、磁共振等的影像学检查还难以发现。诊断早期肝癌，AFP比影像学检查要早数月至1 年左右，这能为患者赢得宝贵的治疗时间。原发性肝细胞癌中，70～90% 的患者AFP 呈阳性。

临床上对AFP的检测均使用免疫的方法，不可避免会有假阳性和假阴性的结果。而作为对早期原发性肝癌诊断的有力补充，AFU具有较大的优势。国内对24例肝细胞癌患者进行血清AFU和AFP相关研究，发现AFU诊断敏感为87%，特异性为78%，而AFP则分别为65%和89%（诊断界限为，20ug/L）。提示AFU诊断的敏感性好，而特异性较AFP低。

血清AFU的检测方法有两大类：荧光法与比色法。荧光法利用AFU水解4-甲基伞型酮α-L-岩藻吡喃糖苷释放4-甲基伞型酮产生荧光来进行检测，灵敏度较高，但该法对仪器条件要求高，常规应用有较大困难。比色法中，早期以4-硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷（PNPF）为底物，经AFU水解后释放4-硝基苯酚（4-NP），反应一定时间后用碱性缓冲液终止反应并使4-NP呈黄色，在规定波长下读取吸光度A，利用标准曲线或4-NP的摩尔吸光度可以计算出AFU活性。后来以PNPF为底物还发展了速率法的检测方法，使灵敏度、抗干扰性都有所提高，适用于各种半/全自动分析仪器。但因底物溶解性的问题，需要调节反应pH值为6.1，在这个PH下AFU活性只能达到60%～70%，因此PNPF底物的速率法测值偏低。另外一种以氯化对硝基苯α-L-岩藻吡喃糖苷（CNPF）作底物，灵敏度和精密度较PNP法都有了很大的改善。但大多为干粉试剂，且易受样本中溶血、黄疸及脂血的干扰。