[发明专利]一种干扰素的纯化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种干扰素的纯化方法。本发明在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。同现有技术相比较，可以大幅度的提高干扰素的纯度、比活、稳定性。

背景技术：

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

干扰素根据抗原特异性和分钟结构的不同，分为α、β、γ等型别，而在一特定的干扰素型别内，再根据氨基酸序列或组成方面的差异，划分出不同的亚型，比如：HuIFN（人干扰素）α1、α2等。而在一特定的干扰素亚型内，根据个别氨基酸的变异，以a、b、c在亚型后面进行标记，比如：HuIFNα-1a, α-2a, α-2b等。

HuIFNα已经可以通过基因重组生物工程技术进行量产。但其纯化工艺经过多年研究始终难以解决其纯度问题，比活下降明显，如现有技术“重组人干扰素_2b的提取和纯化” 微生物学免疫学进展 2004 年第 32 卷第 1 期采用离子交换层析柱DEAE sepharose(FF)A柱，柱形XK30/50,以及sephacryl100/50XK层析柱，S-100填料，经过两次层析得到，经过测定，其比活1.2×10⁸IU/mg，蛋白纯度为95%。重组人a2b型干扰素的纯化与鉴定《生物工程学报》1994年 第1期 5 页 61-65页采用单克隆抗体亲和层析一步纯化法对大肠杆菌表达的重组人a2b型干扰素进行了纯化，然后利用凝胶过滤高压液相层析、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｎ端２５个氨基酸的序列测定等方法对纯化产品进行了鉴定。表明一步纯化的重组人a2b达到95%，其比活性为2.54×10^８IU／mg。

本发明经过对不同纯化工艺的研究，筛选出一种纯化方法，本发明采用的技术方案是在纯化工艺中采用了阴离子柱层析，阳离子柱层析，反相填料柱层析三步分离纯化步骤。包括步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人干扰素。

同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，rhIFN电泳纯度由90％提高到98％，HPLC纯度由90％提高到98％，其比活由0.9×10⁷IU/mg提高到3.5×10⁸IU/mg。-30℃条件下稳定性由原有的3个月提高到12个月。可见，采用本发明的重组人干扰素的纯化工艺，可以大幅度的提高rhIFN的纯度、比活、稳定性。

发明内容：

本发明提供一种干扰素的纯化方法，该方法包括以下步骤：

a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；

b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；

c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；

d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；

e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；

f、采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物，再经过脱盐处理，得到干扰素。

其中，所述干扰素选自：干扰素α-1a, 干扰素α-2a, 干扰素α-2b，优选的是干扰素α-2b。

其中步骤a-c属于现有技术，可以根据现有技术中的方法获得。

本发明所述的步骤d-f属于纯化步骤，属于本发明的技术方案，其中，优选的技术方案如下：

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

使用平衡液（20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。

样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2，然后用注射用水将其体积稀释四倍，即为上样液。