[发明专利]利用基因枪获得转基因小麦的方法及其专用培养基有效
申请号: | 201210570736.3 | 申请日: | 2012-12-25 |
公开(公告)号: | CN103898155A | 公开(公告)日: | 2014-07-02 |
发明(设计)人: | 高彩霞;张康;刘金星 | 申请(专利权)人: | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;C12N5/04;A01H4/00;A01H5/00 |
代理公司: | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人: | 关畅;任凤华 |
地址: | 100101 北*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 利用 基因 获得 转基因 小麦 方法 及其 专用 培养基 | ||
1.一种利用基因枪获得转基因小麦的方法,包括如下步骤:
1)取小麦幼胚用权利要求9或10中所述培养基A进行培养;
2)使用基因枪对经步骤1)所述培养的小麦幼胚进行轰击,将目的DNA导入所述小麦幼胚细胞中;
3)将经步骤2)所述轰击的小麦幼胚用权利要求9或10中所述培养基A进行培养;
4)将经步骤3)所述培养的小麦幼胚用权利要求9或10中所述培养基B进行培养获得愈伤组织;
5)将步骤4)获得的愈伤组织用权利要求9或10中所述培养基C进行分化培养,最终获得含目的DNA的转基因小麦植株。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤1)中所述培养的时间为3—5小时;和/或,步骤3)中所述培养的时间为14—18小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:步骤2)中所述轰击的次数为一次;每次所述轰击的轰击距离为6cm,轰击压力为1100psi,轰击直径为2cm。
4.根据权利要求1—3中任一所述的方法,其特征在于:所述轰击使用金粉对待转化DNA进行分散;每次所述轰击中所述金粉的使用量为200μg,所述待转化DNA为1μg;所述金粉的粒径为0.6μm。
5.根据权利要求1—4中任一所述的方法,其特征在于:所述分化培养后还包括生根培养的步骤,所述生根培养使用的培养基为权利要求9或10所述的培养基D。
6.根据权利要求1—5中任一所述的方法,其特征在于:在所述分化培养时使用含筛选剂的所述培养基C;和/或,在所述生根培养时使用含筛选剂的所述培养基D。
7.根据权利要求1—6中任一所述的方法,其特征在于:
所述筛选剂为草铵膦,所述草铵膦在所述分化培养和生根培养中的浓度为5—10mg/L;
和/或,步骤2)中所述轰击时所述目的DNA连接于环形质粒上。
8.根据权利要求1—7中任一所述的方法,其特征在于:
所述培养的温度为22—26℃;
和/或,所述分化培养的光周期为每天24小时中16小时光照、8小时黑暗,光照强度为150μmol/m2/s;
和/或,所述生根培养的光周期为每天24小时中16小时光照、8小时黑暗,光照强度为150μmol/m2/s;
和/或,步骤1)中所述小麦幼胚为开花10-14天的小麦幼胚。
9.一种获得转基因小麦的成套培养基,包含如下分别独立包装的四种培养基中的四种、任意三种、任意两种或任意一种:培养基A、培养基B、培养基C和培养基D;
所述培养基A是由MS基本培养基、甘露醇、2,4-D、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基;所述甘露醇在所述培养基A中的浓度为80—100g/L;所述2,4-D在所述培养基A中的浓度为4.5—5.5mg/L;
所述培养基B是由MS基本培养基、2,4-D、硫酸铜、水解酪蛋白、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基;所述2,4-D在所述培养基B中的浓度为2.0—3.0mg/L,所述硫酸铜在所述培养基B中的浓度为0.5—0.7mg/L,所述水解酪蛋白在所述培养基B中的浓度为0.4—0.6g/L;
所述培养基C是由MS基本培养基、激动素、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基,或由MS基本培养基、激动素、蔗糖、凝固剂和筛选剂制成的固体培养基;所述激动素在所述培养基C中的浓度为0.2—0.3mg/L;
所述培养基D是由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、α-萘乙酸、蔗糖和凝固剂制成的固体培养基,或由1/2的MS基本培养基、乙磺酸、α-萘乙酸、蔗糖、凝固剂和筛选剂制成的固体培养基;所述乙磺酸在所述培养基D中的浓度为0.4—0.6g/L,所述α-萘乙酸在所述培养基D中的浓度为0.4—0.6mg/L。
10.根据权利要求9所述的成套培养基,其特征在于:所述蔗糖在所述培养基A、B、C和D中的浓度为20—40g/L;
和/或,所述凝固剂为植物凝胶,所述植物凝胶在所述培养基A、B、C和D中的浓度为3g/L;
和/或,所述培养基A、B、C和D的pH值为5.6—5.8。
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