[发明专利]HAT半固体筛选培养基以及杂交瘤细胞的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别是涉及一种HAT半固体筛选培养基以及使用HAT半固体筛选培养基的杂交瘤细胞的筛选方法。

背景技术

单克隆抗体技术的基本原理是将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养的骨髓瘤细胞进行杂交，筛选得到的杂交瘤细胞既能分泌抗体又有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，由一个杂交瘤细胞繁殖、分泌的抗体称为单克隆抗体，它只针对一个抗原表位。细胞融合时，B细胞是从抗原免疫的动物的脾脏中分离出来的，骨髓瘤细胞是经过诱变和筛选得到的缺陷型，其本身不能分泌抗体；并且是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型，不能在含有次黄嘌呤(hypoxanthine H)、氨基蝶呤（aminopterin,A）、胸腺嘧啶(thymidine T)的筛选培养基（HAT）中存活。在融合后的细胞群中，未融合的脾细胞和相互融合的脾细胞，不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的骨髓瘤细胞和融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活下来，所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。

一个脾脏中，能分泌抗体的细胞占的比例很少，90%以上的细胞是不能分泌抗体的。即使进行了人工免疫，能分泌出针对人工免疫的抗原的抗体的细胞比例也是很低的，并且两个细胞的融合是随机的，因此，尽管一个成功免疫的脾脏可达到2×10⁸个细胞以上，但细胞融合后能得到目标杂交瘤的数量也是很有限的，如何筛选克隆出这些能分泌目的抗体的杂交瘤细胞是一个非常关键的问题。

杂交瘤细胞的克隆化是单克隆抗体制备过程中工作量最大的部分，实验室传统的克隆化方法为有限稀释法，该法需要多次进行有限稀释获得单克隆杂交瘤，耗时较长，在克隆化之前一些不分泌抗体的杂交瘤往往生长很快，影响分泌抗体的杂交瘤细胞的生长易导致阳性克隆丢失，筛选效率较低。

发明内容

基于此，有必要提供一种筛选效率较高的HAT半固体筛选培养基以及杂交瘤细胞的筛选方法。

一种HAT半固体筛选培养基，每100mL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成：2mL的50×HAT贮存液、20mL的胎牛血清、1mL的100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1mL的100×B细胞刺激因子溶液、2mL的50×杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、1mL的100×异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基；

所述甲基纤维素半固体培养基由按照体积比为1：1的2×DMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀得到。

在一个实施例中，所述2×DMEM培养基通过如下操作制备：将13.5g的DMEM粉末和3.7g碳酸氢钠加入500mL的超纯水充分搅拌溶解，接着调节pH值为7.0~7.2，最后通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到所述2×DMEM培养基。

在一个实施例中，所述4%的甲基纤维溶液通过如下操作制备：称取20g甲基纤维素溶于500mL超纯水中，4℃下搅拌至溶液粘稠均一且没有白色颗粒，最后高压灭菌得到所述4%的甲基纤维溶液。

一种杂交瘤细胞的筛选方法，包括如下步骤：

步骤一、按照体积比为1：1将2×DMEM培养基和4%的甲基纤维溶液充分混匀，得到甲基纤维素半固体培养基；

步骤二、配制HAT半固体筛选培养基，每100mL所述HAT半固体筛选培养基由如下成分组成：2mL的50×HAT贮存液、20mL的胎牛血清、1mL的100×青霉素和链霉素的双抗溶液、1mL的100×B细胞刺激因子溶液、2mL的50×杂交瘤细胞融合克隆因子溶液、1mL的100×异硫氰酸素标记的抗原溶液以及余量的甲基纤维素半固体培养基；

步骤三、将淋巴细胞和小鼠骨髓瘤进行细胞融合后，用HAT液体培养基将融合后的细胞重悬得到细胞悬液，将所述细胞悬液加入到预热至35℃~38℃的步骤二得到的HAT半固体筛选培养基中混匀，37℃静置并排除气泡后倒入平皿中，置于37℃、5%CO₂的孵育箱培养；

步骤四、步骤三得到的细胞在37℃、5%CO₂的孵育箱培养10~14天，待所述平皿中长出肉眼可见克隆集落时，在荧光显微镜下对周围具有强荧光信号的阳性细胞团分别进行标记，然后在显微镜下将已标记的阳性克隆挑出，所述阳性克隆即为所述杂交瘤细胞。