[发明专利]一种藻毒素降解菌的原生质体制备与再生

说明书

技术领域

本发明涉及水处理微生物技术领域，具体涉及一种藻毒素降解菌的原生质体制备与再生。

背景技术

近年来，随着社会经济的发展，大量含氮磷等营养元素的污水进入自然水体，导致水体富营养化问题日渐严重，我国一些地区如太湖、巢湖及滇池等流域蓝藻水华年年爆发。湖泊或水库中发生蓝藻水华，不仅削减其生态调节和水体自净的能力，同时藻体堆积死亡、藻细胞破裂分解过程中，向水体释放大量藻毒素。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是目前我国出现频率最高、毒性最强、急性危害最大的一类藻毒素，它对人类和其他生物的脾脏、肝脏、肾脏、大肠、心脏等都具有明显“三致”毒害作用，危及环境生态并对人们饮用水安全构成威胁。

MC-LR分子形态呈七肽环状，结构稳定，加热、煮沸等一般方法不易将毒性去除，这也加大了控制和消除MC-LR污染的难度。传统的净水工艺，如国内水厂广泛采用的混凝、沉淀和过滤工艺不能有效去除MC-LR，其中混凝、沉淀通过去除藻类而去除细胞内的MC-LR，但不能去除细胞外溶解性MC-LR，而过滤可去除部分细胞内的MC-LR，但对细胞外MC-LR的去除作用较弱，不能保证出水MC-LR达标。因此，迫切需要寻求能有效去除饮用水中MC-LR的方法。国内外学者对环境水体中MC-LR的降解与去除进行了多方面研究，对饮用水中MC-LR比较有效的处理技术有活性炭吸附、光降解与光催化氧化、臭氧氧化、化学药剂氧化、膜滤及生物降解等，但这些技术均存在一些不足——易产生二次污染（生成较多有机副产物）、能耗大、运行成本高等，难以应用于实际工程中。微生物法是处理MC-LR较有效的一种方法，它既可以减少物理法人力、物力及财力的大量投入，又可以避免化学法二次污染的风险。《生物学杂志》（2010）第27卷第6期57-64页报道了钟升等从巢湖底泥中分离出5株菌，并利用其对微囊藻毒素进行降解，其中M9菌48h对MC-LR降解率达到62.2％。专利授权发文号为2012061900548110的专利，张文艺等(即本发明人)从太湖蓝藻重污染河浜底泥中筛选到的一株MC-LR降解菌，对MC-LR的降解率可达到66.95%。虽然目前已有不少关于MC-LR降解菌的研究报道，但从自然界中筛选得到能够降解MC-LR的菌株种类不多，种群结构较单一，降解效率不高且降解菌的环境适应性不强，难以用于实际的工程中。本发明以筛得的自然菌株为基础，采用原生质体融合技术制备该藻毒素降解菌的原生质体。

原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是将两个遗传性状不同的亲株通过基因重组得到兼具两者优良性状的融合菌，是一种构建高效工程菌的技术方法。《高校化学工程学报》（2009）第23卷第6期1064-1068页报道了何光裕等采用原生质体融合技术制备2株脱色菌的原生质体，并由此构建了一种高效脱色工程菌H-1，对染料废水有比较好的脱色效果。

原生质体制备与再生是进行原生质体融合的首要和前提条件，它直接影响着后续融合实验及融合子再生的顺利进行。目前国内外研究显示，菌株原生质体制备与再生率大多处于较低水平，且波动性很大。探索适合特定菌株的最佳制备与再生条件，提高其制备与再生率，对于该菌株后续转基因研究具有重要意义。

针对MC-LR的生物降解菌种类不多，种群结构较单一，降解效率不高等问题，研究MC-LR降解菌的原生质体制备与再生对后续构建高效MC-LR降解工程菌具有重要的理论和实用价值。

本发明制备了本实验室分离保存的1株MC-LR降解菌R3（Lysinibacillus fusiformis）的原生质体，该菌是本实验室从蓝藻脱水压滤液中分离出来的一株降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，当添加葡萄糖为外加碳源时其对MC-LR的去除率可达到59.26%。该降解菌的国家发明专利申请号为201210275635.3，并在美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank进行了注册（注册序列号为JQ991002），同时送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（保藏号为CGMCC NO.6107）。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解MC-LR的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌R3的原生质体制备与再生。

本发明所采用的具体技术方案如下：

本发明的原生质体制备与再生按照下述的具体步骤进行操作：

A、种子培养液的制备

从纺锤形赖氨酸芽孢杆菌CGMCC NO.6107的斜面培养基中挑取一环菌接入新鲜细菌液体培养基，28℃下活化培养5-60h至不同的生长期，得到种子培养液；

B、菌丝悬液的制备