[发明专利]含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体及其构建方法。

背景技术

不管是制备单克隆抗体还是制备多克隆抗体，抗原的设计与制备都是非常重要的问题。设计或者制备得到不好的抗原有可能完全不能免疫出抗体来或者免疫出的抗体特异性和亲和力很差。常用的抗原形式包括:纯化的天然蛋白、纯化的重组蛋白、人工合成的多肽、小分子物质、组织或细胞成分。

天然蛋白结构完整，因此是很好的抗原，但是天然蛋白很难达到较高的纯度，而且对于含量很低的蛋白，很难分离到足够的蛋白。而为了制备特异针对某一抗原表位（抗原决定簇）的抗体，可以人工表位肽用于免疫，但是多肽分子一般8~20个氨基酸，分子量太小，很难引起机体的免疫反应，所以合成的多肽后需要与一个大的载体蛋白连接以增加其免疫原性。但是这种方法的成本较高且制备出的抗体亲和力较低。小分子物质，主要是小分子药物，分子量一般不超过1000Da，小分子药物属于半抗原，也需要连接载体才能够进行免疫动物。有时候也可用从组织直接分离的细胞或体外培养的细胞进行免疫，完整的细胞具有更强的颗粒性和外源性，但是这种方法复杂，成本更高。

相对于上述几种常用的抗原形式，重组蛋白以其来源容易、制备简单、纯度较高，成为研究的热点。而且随着基因工程技术的迅速发展，重组蛋白的表达载体和纯化方式变得丰富多样。但是重组蛋白的表达载体通常需要带一段标签，如GST、Myc、MBP、Flag等，用于后续表达的蛋白的鉴定和纯化，但是在免疫中动物体通常会产生这些标签的抗体，尤其对于大分子量的标签，而且重组蛋白表达载体还普遍存在表达水平低的问题。

发明内容

基于此，有必要提供一种表达水平较高的含鼠lgG2b抗体的Fc标签的酵母表达载体。

一种含鼠lgG2b抗体Fc标签的表达载体，包括鼠lgG2b抗体Fc段基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA，所述鼠lgG2b抗体Fc段基因连接在所述毕赤酵母表达载体pPICZαA的NotⅠ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，其中，鼠lgG2b抗体Fc段基因的序列为SEQ ID NO.1。

由于毕赤酵母蛋白表达水平高，规模大小容易控制，成本低廉，操作简单，且本身分泌的蛋白水平低，有利于下游产品的分离纯化，因此可以作为外源基因的表达载体。而lgG2b是鼠体内含量较高的抗体亚型。因此，上述含鼠lgG2b抗体的Fc标签的表达载体具有较高的表达水平。

且上述含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体能表达带有鼠Fc标签的融合蛋白，表达得到的带有鼠Fc标签的融合蛋白可直接用蛋白A或蛋白G进行纯化，纯化方法简单且获得的带有鼠Fc标签的融合蛋白纯度高；而且带有鼠Fc标签的融合蛋白可以直接免疫小鼠用于鼠单克隆抗体或多克隆抗体的制备，不用切除标签序列，因为Fc片段来自小鼠，对小鼠无免疫原性或免疫原性很低，不会产生与Fc标签的相应的抗体；同时还可以用抗小鼠lgG抗体的二抗对带有鼠Fc标签的融合蛋白进行检测，检测过程简单、结果可信度高。此外，带有鼠Fc标签的融合蛋白因Fc的二硫键作用形成二聚体，从而得到具有相对较大分子量的蛋白，提高了其稳定性和免疫原性，因此上述含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体特别适用于小分子蛋白或多肽的表达，克服小分子蛋白或多肽因分子量小而存在免疫原性低的问题。

一种含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体的构建方法，包括如下步骤：

提取小鼠脾脏的总RNA，并反转录合成cDNA第一条链；

以所述cDNA第一条链为模板、序列为SEQ ID NO.2的DNA链作为上游引物及序列为SEQ ID NO.3的DNA链作为下游引物进行PCR扩增，得到PCR产物，其中，上游引物的序列中含有NotⅠ酶切位点，下游引物的序列中含有终止密码子与XbaⅠ酶切位点；

分别用NotⅠ酶与XbaⅠ酶对毕赤酵母表达载体pPICZαA与PCR产物进行双酶切反应，回收并纯化得到含鼠lgG2b抗体Fc段基因的酶切产物及毕赤酵母表达载体pPICZαA的酶切产物；

采用DNA连接酶对回收并纯化的两种酶切产物进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，用Zeocin的LB平板筛选，挑选单菌落后提取质粒经酶切鉴定和测序鉴定后得到所述含鼠lgG2b抗体Fc标签的酵母表达载体，其中，鼠lgG2b抗体Fc段基因连接在所述毕赤酵母表达载体pPICZαA的NotⅠ酶切位点和XbaⅠ酶切位点之间，鼠lgG2b抗体Fc段基因的序列为SEQ ID NO.1。