[发明专利]一种通用的植物表达载体构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建通用植物表达载体的方法，属于生物技术领域。 

背景技术

在植物基因工程研究中，构建植物表达载体是很重要的一个环节。载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介，没有载体，目的基因无法进入受体，即使进入受体细胞也无法表达。细菌质粒载体或噬菌体载体连接启动基因及多聚核糖体的基因序列就组成了表达型载体。表达载体的构建是一项非常重要但又比较繁琐的工作，因此，研究表达载体的构建方法便具有重要的现实意义。 

随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。在为某种特定的植物构建表达载体时，为了使外源基因高效、安全表达，或由于特定的要求，需要构建新载体或改造已有载体，而选择一种合适的载体构建方法，从而达到方便、快捷的目的就显得十分重要。 

传统的载体构建方法，主要是在体外经限制性内切酶酶切质粒载体DNA，然后在DNA连接酶的作用下同目的基因结合成环，最终得到转化载体。在此过程中，一般的步骤是，先在具有多克隆位点的初步载体上寻找合适的酶切位点，得到入门载体。为了与合适的启动子、选择性标记基因等序列元件连接，中间还需要转换多个载体和一系列的酶切、连接、转化、回收等工作，因此，传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂载体时，其路线设计和实际操作往往比较麻烦，通常需要构建多个中间载体，费时费力。但是，在没有更便捷的方法之前或者构建的载体比较简单时，采用传统的构建方法还是一种比较安全、稳妥的选择，而且能够获得预期的结果。 

Gateway技术是Invitrogen公司开发的一项基因克隆和表达的新技术，它利用位点特异重组构建入门载体(entry clone)后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，而且一旦拥有了一个入门载体，就可以利用它将目的基因多次转移到各种不同的表达载体(目的载体，destinationvector)上。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不会影响不同基因的测序结果，因而每当使用一种新的表达系统时，可以节省大量时间。Gateway技术是一种通用性的克隆方法，利用该技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统中，用于基因的蛋白质表达和功能分析。Gateway的优势有以下几个方面：(1)简单快速的反应：在室温60min后即可转化E.coli；(2)克隆效率高：＞90％甚至＞99％的克隆是目标克隆；(3)快速直接克隆PCR产品；(4)特异性反应：保持阅读框架和基因的位置不变。目前，Gateway技术已经应用在许多领域中，如构建RNAi载体时优先考虑使用此技 术。 

含三段T-DNA载体是获得无筛选标记转基因植株关键。抗生素筛选标记基因是目前转基因植物安全性的隐患之一，很多植物转基因材料因此而不能获准商品化生产。现在有几种无筛选标记的植物转基因技术，包括共转化法(cotransformation)、定位重组体系(site-specificrecombination)、多元自动转化载体系统(mult-auto-transformation vector)、转座子系统(transposition system)和同源重组体系(homologous recombination)等，但只有共转化法的应用最为成功。共转化法就是利用基因枪介导将分别携带目的基因和标记基因的二个质粒载体混合转入受体细胞中，之后即可在T1或T2的分离后代中获得无筛选标记的转基因植株，不足的是转化频率比较低。利用分别含有不同双元表达载体的农杆菌混合侵染植物细胞，同时含有二个不同双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞或含有二段T-DNA双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞。由于目标基因和选择标记基因位于不同载体或不同T-DNA上，后代中能够获得无标记转基因植株，获得频率同样比较低。