[发明专利]引物及该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种引物及该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法。

背景技术

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速,自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系细胞白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟的细胞过度增生，因此慢性白血病应是一种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病（CML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此确诊后，应进一步分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的结果。

白血病的诊断和治疗，一直是国际性的重大难题。近年来，随着各种诊断技术的不断发展，特别是分子生物学研究手段的不断更新，其在血液病诊断中所起的作用越来越重要。尤其是对有明显检测靶标的白血病的诊断，分子生物学的检测结果已经不可或缺。

Ph染色体是在血液病中最早确定的染色体异常，主要出现在慢性粒细胞白血病和部分急性淋巴细胞白血病中，它是由9号和22号染色体易位造成的。这种易位也造成了位于22号染色体上的BCR基因和位于9号染色体上的ABL基因的融合，产生了一个新的BCR/ABL融合基因（图、1）。应用分子生物学方法（RT-PCR）检测该融合基因的存在，已经成了确诊CML或ALL的重要参考依据之一。近年来慢性粒细胞白血病(CML)的分子生物学研究不断有新的进展，其中之一就是陆续报道了多种不同融合位点的BCR/ABL融合基因。而且不同的融合型的BCR/ABL融合基因对病程的影响和治疗的反应是不尽相同的。例如P190比P2l0的致癌能力更高,表达更倾向于导致AL表型。因此，从CML和ALL病人中检测出存在BCR/ABL融合基因与否，以及确定具体的融合型，对于CML和ALL病人的诊断和治疗方案的选择均有重大意义。

在实际应用中，用于检测BCR/ABL融合基因的方法主要为荧光原位杂交和RT-PCR法。但目前使用这两种方法来对BCR/ABL融合基因进行检测的，均是只针对某种特定的融合型进行检测。如要对目前已知的所有融合型的BCR/ABL融合基因进行检测，则只能一个一个单独进行检测，费时费力，且检测成本非常昂贵。因而急需一种能同时对所有已知的融合型的BCR/ABL融合基因进行筛查的方法，省时省力，更有利于患者的及时诊治。多重PCR技术则能够解决这种需求。

多重PCR技术是在传统PCR原理上进行改进，即在同一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。应用多重PCR技术，设计出针对9种已知融合型BCR/ABL融合基因（e1a2,e1a3,e6a2,e8a2,e13a2,e13a3,e14a2,e14a3,e19a2）（图、2）的公共特异性引物，并避免各对特异性引物之间的相互干扰，即可实现在同一检测体系中，对这些不同型的BCR/ABL融合基因进行一次性检测。节约了大量的检测时间和检测成本。因此本研究采用多重PCR技术应用于9种已知融合型的BCR/ABL融合基因的筛查检测。

发明内容

本发明设计了检测内参/目的基因用引物序列，采用多重PCR技术，一次性检测9种已知融合型BCR/ABL融合基因的存在与否，试剂盒通过调整公共检测引物的比例，以及PCR反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种引物，所述引物序列如下:

BCR-1:ACCTCCAGCGAGGAGGACTTCTC

BCR-6:AACCTGAGAGCCAGAAGCAACAAAGATG

BCR-12:GGAGAACATCCGGGAGCAGCAGAAG

BCR-19:GCACTGAAGGCAGCCTTCGACG

BCR-R:GGATGTCCGTGGCCACACCGGAC

ABL-3:CCCCATTGTGATTATAGCCTAAGACCCGG。

本发明的另一个目的是利用该引物筛选9种已知BCR/ABL融合基因方法，包括如下步骤：

（1）、RNA的提取；