[发明专利]一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的快速纯化方法

权利要求书

1.一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，其特征在于采用多次差速离心的纯化方式纯化病毒，具体步骤如下：

(1) 取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取内脏与鳃剪碎后，置于预先冰浴过的8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂；

(2) 将匀浆后的组织悬液分装于50ml离心管中，4℃ 6000g离心10min，收集上清液，将离心所得沉淀的用高盐TNE2缓冲液重悬，再次匀浆数分钟，4℃ 6000g 10min离心，收集上清液；将两次离心所得上清液合并；

(3) 将合并后的上清液经8000g，4℃ 离心20min，取上清液；

(4) 将步骤（3）得到上清液于4℃ ，35000g离心1.5h，将离心所得的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色部分重悬于1-3ml的TM2缓冲液中，4℃冰浴过夜；

(5) 将浸泡后的下层白色沉淀部分重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，弃去沉淀；取上清液于4℃下，38000g离心1.5h；将离心得到的沉淀上层疏松部分用TM缓冲液小心冲洗掉，下层结实的纯白色部分即纯化的三疣梭子蟹呼肠孤病毒粒子。

2.根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，其特征在于：所述的高盐TNE2缓冲液的各组分浓度为：50 mM Tris-HCl，400 mM NaCl，5 mM EDTA，1mM的蛋白酶抑制剂，pH为8.5。

3.根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，其特征在于：所述的TM2缓冲液各组分浓度为：50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl₂，260mM NaCl, 1mM的蛋白酶抑制剂，pH 为7.5。