[发明专利]一种新型聚芴衍生物的合成及检测肿瘤标志物免疫传感器的应用技术领域

权利要求书

1.一种检测检测免疫标记物的流动注射荧光传感器的制备方法，其包括以下步骤：

（1）聚芴衍生物的合成（PF-NH₂）；

（2）合成二氧化硅包覆的聚芴衍生物（PF-NH₂SiO₂）；

（3）将二抗修饰在PF-NH₂SiO₂；

（4）按照现有方法制备金纳米粒子（AuNPs），四氧化三铁磁性粒子（Fe₃O₄）金纳米粒子包覆的四氧化三铁（Fe₃O₄Au）；

（5）将一抗修饰在Fe₃O₄ Au表面；

（6）利用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制备流动注射荧光流通池；

（7）将制作好的化学发光传感器结合流动注射化学发光仪对免疫标记物进行检测；

本发明所述二氧化硅包覆的聚芴衍生物及二氧化硅包覆的四氧化三铁的制备包括以下步骤：

（1）1,4-二溴对苯二胺（化合物1）

（a）在氮气环境中，加入250 mL无水四氢呋喃（THF），然后再加入4.2 g 氢化钠（NaH），加入5.17 g对二苯胺后加热回流1 h；冷却至室温后加入25 g碳酸二叔丁基酯，搅拌30 min后加入4.2 g NaH，回流12 h；加入大量水使过多的反应物水解，然后用大量乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸镁（MgSO₄）干燥，过滤，减压蒸馏，在乙酸乙酯中结晶得到白色的N, N′-2（叔丁氧羰基）-1,4-二氨基苯；

（b）在氮气环境中，加入9 mL无水乙醚和9 mL无水THF，加入（1）-（a）所得N, N′-2（叔丁氧羰基）-1,4-二氨基苯，冷却至-45 ℃，逐滴加入25 mL 1.3 M的叔丁基锂的戊烷溶液，在-45 ℃搅拌3 h，然后在-55 ℃逐滴加入2 mL一氯三甲基硅烷，反应室温搅拌反应12 h；向反应液中加入10 mL 10%的盐酸溶液，用乙酸乙酯萃取，有机层用MgSO₄干燥，过滤，减压蒸馏，过柱可得白色的N, N′-2（叔丁氧羰基）-1,4-二氨基-2,5-2（三甲基硅烷基）苯；

（c）在氮气环境中，加入无水二氯甲烷，加入（1）-（b）所得N, N′-2（叔丁氧羰基）-1,4-二氨基-2,5-2（三甲基硅烷基）苯，再加入1.53 g NBS，反应在室温搅拌3 h，加入5 mL水，用二氯甲烷萃取，有机层用MgSO₄干燥，过滤，减压蒸馏，重结晶可得白色N, N′-2（叔丁氧羰基）-1,4-二氨基-2,5-2溴苯；

（d）在氮气环境中，加入10 mL三氟乙酸和10 mL无水二氯甲烷于装置中，加入（1）-（c）所得N, N′-2（叔丁氧羰基）-1,4-二氨基-2,5-2溴苯，室温搅拌12 h，然后减压蒸馏，蒸干；向其中加入5 mL无水二氯甲烷，再加入无空气饱和碳酸氢钠溶液，控制pH 8～9，搅拌3 h，用除空气的二氯甲烷萃取，合并有机层，用MgSO₄干燥，减压蒸馏，重结晶得到1,4-二溴对苯二胺；

（2）2,7-二溴-9,9-二（3′-（N, N′-二甲氨基）丙基）-芴（化合物2）的合成

在氮气环境中，加入4 g 2,7-二溴芴和80 mg四丁基溴化铵，加入60 mL二亚甲基亚砜（DMSO）,直接加入8 ml 50% 氢氧化钠（NaOH）溶液；将溶有5 g 3-二甲基氨基丙基氯的盐酸盐（(CH₃)₂N(CH₂)₃Cl·HCl）的溶液加入到20 mL（DMSO）并滴加到混合物中，搅拌12 h；向反应液中加入50 mL的水，溶解剩余盐类；将得到的产品萃取、洗涤；洗涤后的溶液用无水MgSO₄干燥，减压过滤，旋蒸蒸除溶剂，得到黄色2,7-二溴-9,9-二（3′-（N, N′-二甲氨基）丙基）-芴；

（3）对二乙烯基苯（化合物3）的合成

（a）在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中加入5.8 g N-溴代琥珀酰亚胺（NBS），0.10 g过氧化苯甲酰，再加入2.0 mL对二甲苯和60 mL 四氯化碳（CCl₄）；磁力搅拌器搅拌至所有固体溶解；加热回流12 h；停止反应后，趁热过滤，洗涤沉淀，滤液冷却后进行重结晶，得到白色针状结晶，即对二溴二甲苯；

（b）在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中加入4.94 g（3）-（a）制得对二溴二甲苯和9.0 g三苯基磷，再加入30 mL 无水二氯甲烷和 30 mL甲醛；过滤、洗涤沉淀，得到白色粉末状对二溴二甲苯的季磷盐；

（c）在氮气环境中，将（3）-（b）所得对二溴二甲苯的季磷盐转移到250 mL的三颈烧瓶中，再加入30 mL 无水二氯甲烷和 30 mL甲醛；向反应溶液中逐滴滴加20 mL 5% NaOH溶液，搅拌反应物12 h，停止反应；萃取洗涤沉淀，无水MgSO₄干燥过夜；减压蒸除溶剂，得到白色针状对二乙烯基苯；

（4）聚芴衍生物（PF-NH₂）的合成

在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中依次加入0.19g（1）制得1,4-二溴对苯二胺，0.10 g （2）制得2,7-二溴-9,9-二（3′-（N, N′-二甲氨基）丙基）-芴，0.10 g（3）制得二乙烯基苯、25 mg的醋酸钯（Pd(OAc)₂）、0.3 g的三苯基磷（PPh₃）、60 mL DMF、50mL三乙胺，在150 ℃加热回流48 h；反应停止后，用三氯甲烷萃取，有机层用MgSO₄干燥，过滤，减压蒸馏，得到棕黄色新型聚芴衍生物（PF-NH₂）；

（5）将（4）制备的PF-NH₂配制溶液（1 nM，溶于DMF中）；在一个100 mL的单口瓶中加入1 mL PF-NH₂溶液，8 mL乙醇，搅拌分散均匀；然后加入0.1 mL氨水溶液（25%），10 μL的正硅酸四乙酯溶液（TEOS，体积浓度1/20的TEOS乙醇溶液）搅拌30 min；继续加入10 μL TEOS溶液并搅拌30 min直到加入的TEOS溶液总量为50 μL；反应结束后，在10000 r·min^-1转速下离心分离，用乙醇洗涤沉淀，反复三次；在真空干燥箱中以50 ℃干燥5 h得到二氧化硅包覆的聚芴衍生物（PF-NH₂SiO₂）；

（6）在一个10 mL 的小烧杯中加入（5）制备的PF-NH₂SiO₂ 0.02 g， 将1 mL新制备的N,N’-羰基二咪唑溶液（CDI，100 mg·mL^-1，溶于DMSO）加入并搅拌4 h；反应完全后，加入过量的二次水是过量CDI分解，在10000 r·min^-1转速下离心分离，用二次水洗涤沉淀，反复三次；将修饰的PF-NH₂SiO₂溶于磷酸缓冲溶液中（PBS，pH 7.4），加入一定量的二抗（Ab₂）原溶液并在4 ℃下活化2 h；在10000 r·min^-1转速下离心分离，加入1 mL 牛血清白蛋白（BSA，1%）在4 ℃下活化2 h；在10000 r·min^-1转速下离心分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次；最后在沉淀中加入PBS至Ab₂浓度为20 μg·mL^-1；

（7）利用传统方法制备金纳米粒子（AuNPs）和四氧化三铁磁性粒子（Fe₃O₄）；在一个100 mL的圆底烧瓶中加入0.1 g Fe₃O₄纳米粒子，加入10 mL乙醇，然后加入0.5 mL APTES并磁力搅拌1 h，用磁铁进行分离，用二次水冲洗；加入1 mL AuNPs（1%），加入10 mL并磁力搅拌2 h；用磁铁进行分离，用二次水冲洗；在真空干燥箱中以50 ℃干燥10 h即得金纳米粒子包覆的四氧化三铁（Fe₃O₄Au）；

（8）将（7）Fe₃O₄Au制备粒子0.01 g溶于PBS中，加入一定量的一抗（Ab₁）原溶液并在4 ℃下活化2 h；用磁铁进行分离，加入1 mL BSA溶液，在4 ℃下活化2 h；用磁铁进行分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次；最后在沉淀中加入PBS至Ab₁浓度为20 μg·mL^-1；

（9）在1 mL的离心管中加入10 μL（7）制备的Ab₁溶液，然后加入10 μL一定浓度的抗原（Ag）溶液，并在4 ℃下活化2 h；加入10 μL（6）制备的Ab₂溶液，并在4 ℃下活化2 h；用磁铁进行分离，用吸液枪小心的吸取上清液，并用PBS洗涤，反复三次；

（10）利用流动注射化学发光测定（9）中所得物质的荧光信号。