[发明专利]一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用激流灌注式生物反应器制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法，属生物技术领域。 

背景技术

猪细小病毒病(Porcineparvo viurs，PPV)是因感染猪细小病毒所致，可引起猪的繁殖障碍，主要表现为怀孕母猪发生流产、死产、胎儿和胚胎的感染和死亡，而母体通常并不表现临床症状。在世界各地的猪群中，该病毒普遍存在，在大多数猪场一般呈地方性流行或散发，而且很难根除给养猪业造成巨大的经济损失。PPV的感染尚无有效的治疗方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重要。 

公认使用疫苗是预防猪细小病毒病、提高母猪繁殖率的有效方法。目前PPV疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亚单位疫苗、基因工程活病毒载体疫苗等，其中灭活疫苗具有安全性好、成本低、产生抗体时间长、不需要低温保存的优点，被广泛应用。 

目前中国生物制品行业生产猪细小病毒大多是采用贴壁依赖性细胞，如猪睾丸传代细胞ST、猪肾细胞PK-15、猪肾细胞IBRS-2，多采用传统转瓶培养或静置培养，该工艺虽已沿袭数年，但难以摆脱效价不稳定，批间差异大，病毒滴度低等弊病，极大地限制了猪细小病毒病灭活疫苗的质量与产量。近几年，随着兽用疫苗行业的发展，生物反应器被广泛关注，利用生物反应器替代传统的转瓶生产工艺已成为行业发展的趋势。 

生物反应器作为一种新型工具，能有效提高细胞产量，稳定疫苗批间差异，也被应用于规模化生产猪细小病毒疫苗。专利《应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗》（专利号 ZL 201010282134.9）中公布了一种应用搅拌式生物反应器生产猪细小病毒的方法。专利《一种猪细小病毒灭活疫苗的制备方法》（专利号ZL 201010277502.0）中公布了一种应用美国NBS公司生产的生物反应器生产培养细胞进而生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法，其培养体积达到了40L。但是，应用激流灌注式生物反应器生产猪细小病毒病灭活疫苗的方法未见报道。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术之缺陷提供一种利用激流灌注式生物反应器制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法。 

本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。 

一种制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反应器为培养系统，所述激流灌注式生物反应器包括第一蠕动泵、第二蠕动泵，第一硅胶管、第二硅胶管、激流罐、灌注袋、有孔硅胶管和聚酯纤维纸片载体；所述灌注袋为内含聚酯纤维纸片载体的细胞培养袋，两个灌注袋结构与功能完全相同，以相同的方式与激流罐连接，通过外源泵实现物质交换； 

灭活疫苗的制备按以下步骤进行：

a.制苗用细胞的培养

将细胞悬液即种子细胞和细胞生长液的混合液接种至激流灌注式生物反应器的灌注袋（6），使细胞贴附在聚酯纤维纸片载体（8）上，接种密度为每克载体接种0.8～1.2×10⁷个细胞，设定设备参数：温度T1：37.5～38℃、T2：43～46℃、T3：35.5～37℃，pH：7.2～7.8，DO：30%～70%、振荡速度40～55r/min，空气流量100ml/min～1000ml/min，启动细胞培养程序，进行细胞培养，得到制苗用细胞；

b.病毒接种与培养

当细胞单日耗糖趋于平稳时，表明细胞达到接毒要求，排空反应器内液体，将猪细小病毒种毒接种制苗用细胞，设定设备参数：温度T1：35～38℃、T2：37～40℃、T3：34～36℃，pH：7.3～7.8，DO：30%～70%，振荡速度35~50r/min，空气流量400 ml/min～4000ml/min，启动病毒培养程序，扩增培养猪细小病毒；

c.病毒液收获

病毒培养40～42h后，收获激流罐（5）与灌注袋（6）内的病毒液，将灌注袋（6）反复冻融2～3次后收获上清液，混合后-20℃保存备用；检测病毒液效价和血凝价；

d.病毒液灭活

收获的病毒液中加入灭活剂，灭活病毒；

e.疫苗制备

灭活的病毒液加入佐剂，乳化制备成猪细小病毒病灭活疫苗。

上述制备猪细小病毒病灭活疫苗的方法，步骤a中，种子细胞为猪肾细胞IBRS-2或猪睾丸传代细胞ST，均为经过有限稀释法克隆纯化筛选的细胞，应用有限稀释法将待筛选细胞进行单克隆化，扩大培养建立单克隆化细胞库，通过血凝和TCID₅₀筛选猪细小病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株。