[发明专利]一种植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillusplantarum ST-Ⅲ)耐盐基因的筛选方法。 

背景技术

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)是人类应用最早的细菌之一，长期以来，这些细菌一直用于生产动物(奶、肉、鱼等)和植物(蔬菜、酒等)发酵食品。乳酸菌在发酵过程中如发酵干酪、香肠、鱼、酱油、蔬菜以及食品保藏过程中会遇到高盐浓度，高盐浓度引起的高渗透环境会导致细胞在结构上和生理上的损伤。而植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillusplantarum ST-Ⅲ)是从泡菜中分离出来的乳酸菌，其粘附性能强，具有清除胆固醇的益生特性，耐渗透能力强，甚至可以在含有8％NaCl的环境中生长。因此有必要了解植物乳杆菌ST-Ⅲ的耐盐机制，以便更好的利用其耐盐性能，挖掘其益生特性。目前对致病菌及嗜盐菌的耐盐机制研究较多，而对乳酸菌，特别是对乳酸杆菌的耐盐机制，尤其是结合高通量测序技术系统性发掘植物乳杆菌的耐盐基因比较少见。 

随着科学技术的不断发展，测序技术也迎来了新的发展，以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的Solid技术为标志的新一代测序技术相继诞生并投入商业应用。其中Illumina/Solexa测序平台上的RNA-seq技术应用最广。由于其具有高通量、可重复性、检测范围宽、定量准确等特点，已经广泛应用于各种生物转录组的研究。 

在目前已经公开的文献与专利或专利申请中，例如CN 102409099A使用转录组学的方法对金华猪和大约克猪乳腺组织基因的差异表达进行了分析，为深入研究猪泌乳发育、泌乳过程中相关基因的功能和调控机制提供了基础材料。CN 102732527公开了一种基于转录组学的沙冬青抗旱基因的筛选方法，用于获得优良的沙冬青抗旱基因。CN 102277416A全面准确的获得了亚洲玉米螟的全基因组转录本信息、功能基因表达量及代谢通路信息。但是，这些专利或专利申请没有完全涉及细菌，特别是益生乳酸菌的耐盐基因的筛选。因此，目前还需要一种有效的方法获得乳酸菌，特别是耐盐乳酸菌的耐盐基因。 

本发明获得的耐盐相关基因正是利用RNA-seq技术对植物乳杆菌ST-Ⅲ转录组进行深度测序所得。这对植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的发掘，对其益生功能的进一步开发，及商品产业化都提供了基础及有效途径。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的筛选方法，能够迅速有效的筛选植物乳杆菌ST-Ⅲ的耐盐基因。 

为达到上述技术目的，本发明采用以下技术方案： 

植物乳杆菌ST-Ⅲ(Lactobacillus plantarum ST-Ⅲ)耐盐基因的筛选方法，包括以下步骤： 

(1)收取在含盐及不含NaCl的培养基中生长的植物乳杆菌ST-Ⅲ菌体； 

(2)提取RNA，纯化，rRNA消除； 

(3)建库； 

(4)高通量测序； 

(5)获得差异表达序列； 

(6)检索及软件分析获得耐盐基因。 

上述植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的分析中，所述步骤(1)中菌株在不含有盐及含有6％NaCl的培养基中生长到对数中前期时收集菌体，4℃离心，弃上清。 

上述植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的分析中，所述步骤(2)中提取RNA包括以下步骤： 

(a)将适量植物乳杆菌ST-Ⅲ菌体用液氮研磨； 

(b)加入TRIzol研磨，放置至溶解； 

(c)以上述液体于无菌管中，加入三氯甲烷混匀，4℃离心，取上清； 

(d)加入异丙醇，4℃离心，弃上清； 

(e)70％无水乙醇洗沉淀，4℃离心； 

(f)无酶水溶解； 

(g)琼脂糖凝胶电泳检测，Nanodrop定量，-80℃储存。 

上述植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的分析中所述步骤(c)重复两次； 

上述植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的分析中所述步骤(4)测序后使用Bowtie软件将测序结果与原有基因组测序结果进行比对。 

上述植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的分析中所述步骤(5)中获得的差异表达基因进行筛选，选取差异表达2倍以上的基因。 

上述植物乳杆菌ST-Ⅲ耐盐基因的分析中所述步骤(5)(6)中应用Cufflink软件对转录组进行差异表达分析。