[发明专利]一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法

说明书

技术领域

本发明涉及革兰阴性菌基因敲除技术，尤其涉及的是一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法。

背景技术

革兰阴性菌是人和动物常见的病原细菌，肠杆菌科的大肠杆菌和沙门菌可引起人和动物不同的疾病，如腹泻、出血性肠炎等。而研究这些病原菌的毒力基因及其功能可为这些疾病的免疫防制奠定理论基础。

基因敲除技术是研究基因功能的一种常用方法。常规的基因敲除技术是基于同源重组的双交换或者单交换，将靶基因用特定的标记基因(如抗性基因)替换，以达到完全去除靶基因的目的。但由于基因在染色体上是以双链的形式存在，当同源重组交换目的基因时，将目的基因的正反向链同时交换去除，因此获得的突变体实际上是两条单链的同时缺失，而突变体所表现出的表型也是正反两条单链上的基因共同缺失所表现出来的。所以，常规的同源重组基因敲除技术还需做回复突变以验证目的基因的功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于定向点突变的革兰阴性菌无疤痕基因敲除方法，以质粒pKD267为模板，选目的基因上下游各500 bp处的序列50 nt加pKD267上的序列20 nt用以扩增质粒上的抗性基因(kan)和细胞死亡控制基因(ccdB)，采用电转法将PCR产物转化入目的菌，该目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶，以卡那抗性筛选阳性克隆。

分别在目的基因上下游各500bp和目的基因开放阅读框内设计引物，同时在目的基因的开放阅读框引入点突变，使其起始密码和其互补链相应位置突变为AAA。进行两次PCR，引物5a-RECO-RED和luxS-RECO-RED扩增luxS上游500bp和luxS基因，在起始密码ATG的互补链上引入点突变AAA。引物3a-RECO-RED和luxS-5a-RED扩增luxS下游500bp和luxS基因，在编码链起始密码ATG处引入点突变AAA。

两次PCR产物混合后进行第三次PCR，获得的长片段，再利用同源重组技术，将PCR产物直接转化第一次的阳性克隆菌(此时的目的菌已经被提前转入pKD46，并在30℃条件下，以阿拉伯糖诱导让其大量表达Red重组酶)，以鼠李糖培养基筛选阳性克隆；第三次PCR采用引物对：5a-RECO-RED：5’-CCCAAAGTCGGGAAAGATC-3’、3a-RECO-RED：5’-CGAATTTGCGCCTCGGCATC-3’。

由于细胞死亡因子启动子是鼠李糖诱导的，因此重组成功的克隆不含ccdB基因，可以在限制性培养基上生长，从而获得只有一条正向单链发生点突变的突变体，而其互补链上的基因序列除了引入的点突变外，未发生任何改变。

附图说明

图1为本发明基于无疤痕突变的定向突变技术策略；

图2为第一次插入突变菌落PCR鉴定结果；M：DNA Marker；泳道1-17：待检菌落；泳道18：SL1344野生株；

图3为回复突变菌落PCR鉴定结果；M：DNA Marker；泳道1-10：待检菌落；泳道11：阳性对照；泳道12：阴性对照；

图4为AI-2实验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

一、材料与方法

1.菌株与培养条件

所有的质粒保存在TOP10E.coli中，S.typhimurium SL1344作为突变的对象。带有pKD46的细菌培养在30℃，质粒去除及其它细菌培养在37℃。LB培养基用于常规的细菌培养，SOC培养基用于电转后的恢复培养基。抗生素浓度为：氨苄青霉素100μg/ml，卡那青霉素的浓度为50μg/ml。

2.质粒