[发明专利]苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆及其应用，属于分子生物学和生物技术领域。 

二、背景技术

植物一生中经常遭受各种不良环境和病虫害的侵袭，在长期的适应与进化过程中，植物形成了一系列防御反应机制，用来抵抗不良环境的伤害。其中，环境胁迫主要包括各种生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要来自昆虫、食草动物、植物病菌等；非生物胁迫种类众多，包括干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等胁迫。为了适应繁杂多变的环境，减少不利环境对机体的伤害，植物体内演化出了涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。其中，MdSIMYB2基因对非生物胁迫具有抵抗能力。 

苹果是世界性果品，是温带地区的主要栽培树种。其适应能力较强，果品营养价值较高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品而大力支持。但是在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。近年来，苹果基因组的测序（Velasco等，2010）的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。 

MYB转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非常重要的角色（刘蕾等，2008）。MYB基因在植株中的过量表达能够显著提高植物的抗非生物胁迫能力，在植物抗逆反应过程中，当植物收到外界环境胁迫时植物通过信号转导途径调控体内相关基因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，降低或消除给植株带来的伤害。目前对MYB的研究主要集中在拟南芥、水稻，大豆上等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上低温、干旱、土壤盐渍化和病、虫害导致果树的种植面积和范围受到严重影响。因此挖掘苹果MYB基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。 

随着人们对苹果品质的要求越来越高，品种的改良问题成为科研工作者的一项重要任务，因此苹果育种在世界各国果树研究工作中不断得到加强。但是，苹果为多年生木本植物，通过常规育种选育抗性品种周期长。 

三、发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种苹果抗逆相关基因MdSIMYB2的克隆方法及核苷酸序列，同时提供了该基因在获得抗逆，尤其是在抗旱、抗盐、抗低温的转基因番茄和苹果中的应用，并可应用于生产改良其他粮食作物或经济作物。 

本发明利用同源克隆和RACE技术从苹果嘎啦中获得了苹果新型抗逆境相关基因MdSIMYB2，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白质氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。具体方法如下： 

经NaCl处理24h的嘎啦苹果组培苗提取总RNA，反转录得到cDNA。根据国际基因库中已发布的拟南芥中MYB基因家族的保守氨基酸序列，设计兼并引物，进行常规聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）。将所得PCR产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，并进行测序分析确认；再通过5′-RACE和3′-RACE技术分别获得5′和3′端序列，拼接成完整的cDNA序列。根据cDNA的3′和5′端序列设计特异引物，以嘎啦苹果组培苗的cDNA为模板进行PCR扩增，得到cDNA全长序列。