[发明专利]一株硫丹降解菌NS及其固定化酶在土壤中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株硫丹降解菌NS及其固定化酶在土壤中的应用，属于生物降解处理技术领域。 

背景技术

硫丹（Endosulfan）的化学名为1,2,3,4,7,7-六氯双环(2,2,1)庚-2-烯-5,6-双羟甲基亚硫酸酯，分子式为C₉H₆Cl₆O₃S，分子量为406.91，硫丹原药在常温常压下为固体，常为两种异构体（α-硫丹和β-硫丹，二者比例为7:3）的混合物，化学结构式如下： 

硫丹纯品为白色晶体，混合物为棕色晶体。具有二氧化硫气味；硫丹的相对密度为1.745g/cm³，在25℃的饱和蒸气压1.33×10³Pa，熔点为70-100℃；不溶于水，溶于二甲苯、氯仿、丙酮等有机溶剂；在碱性质中不稳定，并缓慢水解为二醇和二氧化硫；遇湿气逐渐分解失效；不准存放于强氧化剂、强酸、强碱、潮湿空气等环境中，对日光稳定。α-硫丹和β-硫丹有明显的亲脂性，非常接近于联合国环境规划署确定的POPs物质logKOW＞5的标准，表明硫丹具有生物积累的潜力。在2011年召开的《斯德哥尔摩公约》第五次缔约方大会上，硫丹被列入禁用物质列表，全球将在5年后实现禁止硫丹的生产、使用和进出口。 

硫丹最早由德国Farbwerk Hoechst公司1954年研制开发，为有机氯杀虫剂，使用历史已经超过50年，在农业中累计全球使用硫丹量估计是30.8万吨。硫丹在我国被广泛使用，每年硫丹的使用量估计平均2800吨。硫丹进入环境的主要途径是在农业生产中的大规模使用，致使大面积的土壤、水源受到了硫丹的污染。在我国硫丹被广泛应用于棉田和茶叶的病虫害防治，造成了严重的土壤污染和农作物硫丹残留的超标，同时由于硫丹能在鱼体内富集，也造成了水产品硫丹超标。由于硫丹的喷雾施用，大气中也有一定量的残留，使它能够进行远距离的转运。代谢产物硫酸酯、醇、醚、羟基醚和内酯，但只有硫丹硫酸酯仍然含硫元素，具有比硫丹更高的毒性。 

目前，除了禁止硫丹的生产使用外，还没有方法用于修复硫丹污染土壤。固定化酶是在生物修复的基础上发展起来的一项污染修复技术,被认为是有机污染物生物修复技术中最有效、最可行和最可靠的方法。酶的固定化是将原来游离的水溶酶限制或固定于某一局部的空间或固体载体上,固定化酶经过过滤或离心后,可长期反复使用。固定化方法有物理吸附法、 交联法、共价结合法及包埋法等。包埋法不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基,反应条件温和,很少改变酶结构,应用最为广泛。本发明利用硫丹降解菌的固定化酶投加于土壤中，能够迅速降解硫丹，缩短硫丹的半衰期这一特点，筛选出具有降解硫丹能力的微生物，提取其降解酶并将其固定化，应用于硫丹污染土壤中，以达到修复硫丹污染土壤的目的。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一株硫丹降解菌NS及其固定化酶在土壤中的应用；本发明筛选出在偏碱性环境中具有降解硫丹能力的硫丹降解菌NS，以达到修复硫丹污染土壤的目的。 

本发明从生产硫丹农药的污水处理厂排放的污水中采集分离得到了一株硫丹降解菌NS，属于Bordetella petrii，经实验证明其对硫丹具有降解能力。 

一株硫丹降解菌NS(Bordetella petrii NS)，已于2012年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址：中国武汉武汉大学；保藏号为CCTCC No：M 2012327。 

所述一株硫丹降解菌NS形态特征如下：NS菌落呈粉红色，不透明，表面光滑，菌落为圆形，较小，四周规则，显微镜下观察细胞呈杆状，革兰氏染色阳性。 

以硫丹降解菌NS的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1392R:ACGGGCGGTGTGTAC）进行PCR扩增，得到约为1.4kb的扩增产物，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。 

根据Gene Bank序列同源性比较，硫丹降解菌NS与Bordetella pe tri i同处于一个最小的分支，同源性高达99%。结合菌株的生理生化特征，将硫丹降解菌NS初步鉴定为百日咳博名特氏菌NS(Bordetella petrii NS)，命名为硫丹降解菌NS（Bordetella petrii NS）。