[发明专利]稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞学领域，尤其涉及一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方法。

背景技术

Numb是第一个被发现决定多细胞生物不对称细胞分裂的信号蛋白。在果蝇中，Numb通过促进Notch泛素化拮抗Notch信号通路，从而决定子细胞的命运。后来的研究表明Numb是细胞内吞调节蛋白，并用通过内吞参与调节神经细胞的粘附，轴突的生长及细胞迁移等过程。然而，Numb可能还有一些附加功能，以证明Numb被认为在乳腺癌细胞中是肿瘤抑制剂。在乳腺癌细胞中常表现Numb低表达，而研究表明在主要的乳腺癌细胞中Numb低表达导致了p53水平的降低并升高了药物抗性，同时这种Numb的低表达也提高了Notch受体的活性。因此，在这一类癌症中，Numb低表达这一单独的事件就决定了一个致癌基因（Notch）的激活和p53肿瘤抑制通路的衰减。后来研究发现Numb与肿瘤抑制基因p53、泛素化蛋白HDM2形成三聚体抑制p53的泛素化，从而调节肿瘤的恶性程度。

Numb的抑癌作用还不止于。研究表明，小脑颗粒细胞前体细胞(granulecell progenitors,GCPs)来源的肿瘤细胞中的Numb水平是下调的。进一步的研究表明，Numb通过Itch依赖的泛素化，调控Hedgehog的转录因子Gli1的降解，从而抑制Hedgehog信号通路，而这一调控机制的失去平衡将成为肿瘤发生的诱因之一。

Numb既可以拮抗Notch信号，又可以维持p53的稳定性，还可以抑制Hedgehog信号通路，是一个潜在的抑癌分子。

d-Numb在脊椎动物中有两个同源基因Numb基因和Numblike基因，Numblike基因的C端序列与Numb基因也有46.7%的同源性，这表明Numb基因与Numblike基因在功能上有一定的重叠性但又不完全相同。在发育中的新皮质，Numb在从VZ区到CP(cortical plate)的各层都有表达，而Numblike则主要表达在CP层。在神经发生的早期，几乎所有CNS发育的区域，Numb和Numblike可能对于维持神经前体细胞的命运都是必须的。Numb和Numblike对于维持神经上皮结构的完整性是必需的，Numb对于(感觉)神经的形态发育也是必需的。在感觉神经中，Numb和Numblike有可能通过内吞体-溶酶体途径，控制Notch1是进入早期内吞体抑或晚期内吞体，来实现对Notch1的精细调控，并由此影响感觉神经元轴突等。

Numb和Numblike共同发挥着许多重要的作用，Numb和Numblike共同低表达在模拟体内乳腺癌细胞蛋白表达状态上更加合理。

发明内容

基于此，有必要提供一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系及其构建方法。

一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系，包括真核表达载体，所述真核表达载体包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列。

在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

在一个实施例中，所述细胞系为MCF-10A细胞系。

在一个实施例中，所述真核表达载体为pGIPZ质粒。

在一个实施例中，所述用于抑制Numb表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的shRNA插入区。

在一个实施例中，所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列插入到所述pGIPZ质粒的XbaⅠ位点。

一种稳定敲低Numb和Numblike的细胞系的构建方法，括如下步骤：

构建包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，同时制备U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列；

将所述U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列酶切后连接到所述包括用于抑制Numb表达的序列的真核表达载体，得到包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体；

将所述包括用于抑制Numb表达的序列、以及U6启动子和用于抑制Numb Numblike表达的序列的真核表达载体转染到细胞中，得到所述稳定敲低Numb和Numblike的细胞系。