[发明专利]检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法有效
| 申请号： | 201210583426.5 | 申请日： | 2012-12-28 |
| 公开（公告）号： | CN103031383A | 公开（公告）日： | 2013-04-10 |
| 发明（设计）人： | 王振华;张建坤;徐家文;冯汉利 | 申请（专利权）人： | 中华人民共和国湖北出入境检验检疫局 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645 |
| 代理公司： | 武汉华旭知识产权事务所 42214 | 代理人： | 周宗贵;刘荣 |
| 地址： | 430000 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 检测 柑橘 冬生疫霉褐腐 病原菌 方法 | ||
1.一种基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；
（2）、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；
（3）、PCR产物用2%-3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12-20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。
2.根据权利要求1所述的基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PCR缓冲液为10×PCR缓冲液，所加入的去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1、反义引物SPT2、目标物DNA以及TaqDNA聚合酶之间的体积比为16：2.5：1：1：1：1：1：1 ：0.5，其中正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、正义引物SPT1以及反义引物SPT2的浓度均为10μM，dNTPs混合物的浓度为2.5 mM each， TaqDNA聚合酶的浓度为5U/μl，目标物DNA的浓度为100-200 ng/μl。
3.根据权利要求1所述的基于二重PCR扩增检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌和柑橘枝瘤病原菌的方法，其特征在于：步骤（2）中扩增的程序为：94℃ 3min，94℃ 30S，62℃ 30S，72℃ 30S，循环32-36次，最后72℃补时5min。
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