[发明专利]一种普洱茶发酵优势真菌DGGE标准条带制作方法

权利要求书

1.一种普洱茶发酵优势真菌DGGE标准条带制作方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1，从合格的普洱茶样品中获得标准优势真菌DGGE条带；

步骤2，由标准优势真菌DGGE条带获得优势真菌标准条带。

2.根据权利要求1的制作方法，其特征在于，其中步骤1的方法如下：

l）取普洱茶发酵的合格样品；

2）提取微生物总DNA；

3）以微生物总DNA为模板，在专用引物的引导下进行真菌18S rDNA的PCR 扩增；

4）对扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳，sybrgreen I染色后得到DGGE标准图谱；

5）将图谱中优势条带进行切胶回收，得到标准优势真菌DGGE条带。

3.根据权利要求1的制作方法，其特征在于，其中步骤2的方法如下：

l）取标准优势真菌DGGE条带；

2）以标准优势真菌DGGE条带为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；

3）将扩增产物按照一定比例混合；

4）对其进行变性梯度凝胶电泳，经sybrgreen I染色，即得DGGE优势真菌标准条带。

4.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中1）所述合格样品，为经多次机械柜发酵后挑选出来的品评打分和理化指标检测复合普洱茶标准的茶叶样品。

5.根据权利要求2的制作方法，其特征在于，其中2）所述提取的微生物总DNA，包括提取待测样品中真菌18S rDNA。

6.根据权利要求2或3任何一项制作方法，其特征在于，其中所述专用引物如下：第一步扩增引物为GeoA2：5’-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3’和Geo11：5’-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3’；第二步扩增采用的引物为：NS31-GC：5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC -3’和Glol：5’- GCCTGCTTTAAACACTCTA -3’。

7.根据权利要求2或3任何一项的制作方法，其中，

PCR扩增条件为巢式PCR扩增：先加入第一步扩增引物GeoA2、Geo11和反应体系进行第一步扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4 min，然后在94℃变性45s，50℃-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1.5min，循环30次，72℃终延伸10 min；取其产物进行100倍稀释后作为模板，以第二步扩增引物进行扩增，PCR反应条件为：94℃预变性4min，然后在94℃变性45s，50-55℃引物复性45s，72℃引物延伸1min，循环30-35次，72℃终延伸10 min。

8.根据权利要求2或3任何一项制作方法，其特征在于，其中所述变性梯度凝胶电泳，方法是：采用10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，变性剂浓度30-60%，电泳缓冲液采用1×TAE的缓冲液，电压100V，时间10h。

9.根据权利要求3的制作方法，其特征在于，其中3）所述一定比例是将各条带按照等比例进行混合。 

10.根据权利要求1的制作方法制作的DGGE优势真菌标准条带。