[发明专利]微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及环境监测及免疫诊断领域，涉及一种检测方法及检测试剂盒，尤其涉及一种微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

微小隐孢子虫（Cryptosporidium Tyzzer，1907）广泛存在于动物中，亦为人体的重要寄生孢子虫，可引起微小隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）。寄生于人体的种类主要是微小隐孢子虫（C.parvum），该虫是机会致病原虫，但也是一种重要的腹泻病原。该病的临床症状和严重程度取决于宿主的免疫功能与营养状况。免疫功能正常人的感染后，主要表现为急性水样腹泻，一般无脓血，日排便2～20余次，严重感染的幼儿可出现喷射性水样泻，排便量多。腹痛、腹胀、恶心、呕吐、食欲减退或厌食、口渴和发热亦较常见。病程长短不一，短者1～2天，长者数年，20天至2个月上下占多数，由急性转为慢性，进而反复发作者并不少见。该病在国外的研究报道日趋增多，国内近几年也逐渐引起人们的注意。

目前对微小隐孢子虫病早期检测所采用的方法主要还是直接涂片或组织切片法查出确诊。水样的检测方法为过滤纯化富集后进行涂片染色。直接涂片或组织切片法虽然简单快速，但漏诊率高；组织培养和动物发明最真实可靠，但操作烦琐，耗时长，成本高；ELISA方法简便，快速，敏感性尚可，但由于个体免疫系统的差异，有时指标不能真实反映虫体感染的情况，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在临床诊断上受到一些限制。

近些年，已有应用于微小隐孢子虫的研究报道和相关专利。例如，申请号为200880126847专利申请公开了一种检测隐孢子虫的方法及其专用试剂盒；申请号为200710094101的专利申请公开了隐孢子虫快速检测试剂盒；申请号为200510042527.1的专利申请公开了隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体ELISA检测方法及试剂盒；申请号为200810051728的专利申请公开了用于隐孢子虫种属与蓝氏贾第虫检测的多重悬浮芯片及其制备方法；申请号为03126895.1的专利申请公开了隐孢子虫属及隐孢子虫种特异PCR检测试剂盒及检测方法；申请号为200510009966的专利申请公开了饮用水处理过程中隐孢子虫的在线检测与反馈处理方法；申请号为200610030137的专利申请公开了水中贾第虫孢囊和隐孢子虫的检测方法；申请号为200910306998的专利申请公开了提高隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测回收率的过滤浓缩方法。

上述专利多在检测水中或动物血清、组织、排泄物中是否含有隐孢子虫，但并没有一种可以对水体样品和粪便样品中微小隐孢子虫快速分离纯化及定量检测鉴定的方法。

本发明旨在提供一种微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒，能够对水体样品（包括饮用水）、生鲜食品及粪便样品进行快速诊断和检测。

发明内容

因此，本发明的目的是针对目前无法快速灵敏地检测微小隐孢子虫的不足，提供一种微小隐孢子虫的检测方法和检测试剂盒，能够快速、有效地检测待测样品如水体样品、生鲜食品及粪便样品中的微小隐孢子虫。

本发明采用了分离纯化技术-免疫磁珠分离技术（Immunomagneticbead-basedseparation）。免疫磁珠（Immonumagnetic beads，IMB简称磁珠），是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，它将固化试剂特有的优点与免疫学反应的高度特异性结合于一体，以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化以及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面得到了越来越广泛的应用。磁性微球的优点是：（l）粒径小；（2）悬浮稳定性好；（3）具有超顺磁性；（4）操作简便；（5）有良好的物相容性；（6）磁性微粒具有一定的机械强度和化学稳定性。免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic bead-based separation），IMS是一种免疫学检测和分离技术，它是以高均一性的磁性微球为固相支持物，免疫基（如抗体，抗原等）通过功能基团结合到磁性载体上形成免疫磁性微球，利用特性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离检测靶物质。