[发明专利]铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及水体叶绿素a检测技术领域，尤其是一种廉价的、且能够在线实时对水体中叶绿素a的含量进行测定的方法。

背景技术

对于水体中叶绿素a含量的测定，相较于紫外分光光度法、高效液相色谱法等传统方法的步骤繁杂、费时且不便于在线监测等缺点，直接荧光法操作更简便、灵敏度更高，且结果与传统方法相比无显著性差异。荧光法测定叶绿素基本原理是当叶绿素a经波长为450nm左右的光激发后，会发出波长为680nm左右的荧光，荧光光强与叶绿素a含量有关因此，通过测定特定光强下浮游植物发出的叶绿素荧光强度就能检测到叶绿素a的浓度。

目前荧光法中用到的叶绿素a标准品多购自与国外，价格昂贵且剂量较小难以满足大量水体叶绿素含量分析实验的进行。针对这一现状，采用淡水湖泊中最常见且实验室极易培养的铜绿微囊藻作为研究对象，利用荧光法对比测定藻液叶绿素a提取液与叶绿素a标准品的荧光值，做出铜绿微囊藻藻液的直接荧光法校准曲线。从而直接利用此校正曲线测定水体中叶绿素a含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，不仅十分廉价，而且能够在线实时对水体中叶绿素a的含量进行测定。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

铜绿微囊藻替代叶绿素标准物质快速实时测定水体叶绿素的方法，该方法包括如下步骤：

A、铜绿微囊藻叶绿素ａ标准溶液的制备

取铜绿微囊藻液，抽滤，抽滤完毕后取下滤膜，将滤膜夹在滤纸中冷冻，反复冻融，使细胞完全裂解以利于叶绿素a的提取；将滤膜放入比色管中，加入95%乙醇定容，放入4℃冰箱中静置，然后以4000r/min离心15min,将上清液分别转移至容量瓶中用95%乙醇定容；作为储备液备用；

B、储备液中叶绿素ａ浓度的测定

用国标法标定储备液中叶绿素ａ的浓度，以相应的95%乙醇作为空白，用紫外分光光度计测定储备液扫描波长在750nm、664nm、645nm和630nm处的吸光值，将测得的结果数据带入国标法计算公式：

其中chla为叶绿素a的浓度，单位ug/l；E750、E664、E645、E630分别为储备液于波长750nm、664nm、645nm、630nm处的吸光值；V_乙醇为乙醇萃取液的体积，单位ml；V_水样为藻液体积，单位l；＆为比色皿光程，单位cm；通过计算即获得储备液中叶绿素a的浓度chla；

C、储备液荧光测定

步骤B已经计算出储备液中叶绿素a的浓度chla，取适量上述储备液依次稀释成浓度为30、90、150、300、450、600、800、1000、1200、1500、1800ug/l的系列溶液，在激发波长440nm、发射波长684nm、激发与发射狭缝均为5nm条件下,以95%乙醇为空白参比，分别测定各溶液的荧光强度；

D、铜绿微囊藻标准荧光曲线的建立

将储备液的浓度对其荧光强度作图绘制铜绿微囊藻叶绿素ａ荧光法曲线，得到附图1，即得到铜绿微囊藻叶绿素a提取液中叶绿素ａ浓度与荧光强度的相关关系；同时计算其回归方程为y=0.1173x+7.1177，Ｒ²＝0.9947，其中，y为其荧光强度，x为叶绿素ａ浓度，单位ug/l；

E、铜绿微囊藻校正荧光曲线的建立

取铜绿微囊藻水样逐级稀释，配成体积各为20ml的一系列浓度梯度的溶液，然后，

E-1、每一份藻液溶液各取出10ml，分别测定其荧光强度，利用步骤D获得的铜绿微囊藻标准荧光曲线即可换算为藻液溶液中叶绿素ａ的浓度；

E-2、每份藻液溶液剩余的10ml不经任何处理，同条件下测定荧光强度；

E-3、将步骤E-1中所得的叶绿素ａ浓度对步骤E-2中所得的荧光强度作图，即得附图3，为铜绿微囊藻藻液叶绿素ａ浓度与铜绿微囊藻液荧光强度校正曲线；同时计算其回归方程为y=0.0129x+0.4393R²=0.9936，其中y为其荧光强度值，x为叶绿素ａ浓度，单位ug/l；

根据所建立的铜绿微囊藻藻液荧光强度和叶绿素ａ浓度之间的校正曲线，只需采用荧光仪直接测出水样的荧光强度，便可实时、快速得到叶绿素ａ的浓度。