[发明专利]一种多价免疫刺激纳米制剂及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种多价免疫刺激纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术

CpG DNA是一类具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序为核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotides，此时简称为CpG ODN）和自然界中细菌、病毒、无脊椎动物等低等生物的基因组DNA。其中，CpG基序（CpG motifs）是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸。

CpG DNA是首先在卡介苗（BCG）提取液中发现的，它可以刺激多种免疫细胞的活化或增殖，产生多种细胞因子，具有强烈的免疫激活功能。CpGDNA在细菌、病毒基因组中的出现频率远高于在脊椎动物中的出现频率，相应地，脊椎动物的80％胞嘧啶的第五位碳原子是甲基化的。这种显著的差异使脊椎动物可以识别入侵的细菌及病毒，CpG基序成为人等哺乳动物免疫刺激信号的基础。

人工合成的含有CpG基序的DNA序列（CpG ODN）可以完全模仿细菌DNA的刺激性作用，具有激活多种免疫细胞，诱生多种细胞因子的作用，尤其可用于调节例如免疫应答向Th1型转换等免疫学效应。另外，CpG ODN可作为具有治疗性作用的DNA，在抗感染免疫、癌症治疗、过敏性疾病以及免疫佐剂等领域具有巨大的潜在应用前景。

但是，未经过修饰的CpG ODN易降解、摄取率低、需要高剂量重复给药，极大地限制了它在医学领域的应用。

现有的应用于临床实验的CpG ODN主要是DNA骨架经过硫代修饰的硫代磷酸酯骨架，简称为S-CpG ODN。研究表明，通过硫代方法修饰的CpG ODN药物存在明显的毒副作用，重复注射高剂量硫代CpG ODN会引发机体急性毒性，引起剂量依赖性脾肿大、导致肾损伤并造成其它与过度激活免疫相关的毒性表现甚至死亡。

在此基础上，申请人利用巯基修饰CpG ODN，从而将CpG ODN偶联到纳米金粒子表面，稳定地形成自组装纳米结构载体，此时，该自组装结构又被称为CpG ODN-SH-纳米金复合物。该CpG ODN-SH-纳米金复合物具有很低的细胞毒性并在细胞内具有很好的稳定性，另外，该CpG ODN-SH-纳米金复合物还具有良好的生物相容性和高效载运特性。该工作已发表在著名期刊Angew.Chem.Int.Ed.上（Polyvalent Immunostimulatory Nanoagents with Self-Assembled CpG Oligonucleotide-Conjugated Gold Nanoparticles.Min Wei,Nan Chen,Jiang Li,Min Yin,Le Liang,Yao He,Haiyun Song,Chunhai Fan,and Qing Huang,Angew.Chem.Int.Ed2012，51，5：1202-1206）。但是，申请人发现，对CpG ODN进行巯基修饰需要耗费大量的成本，而且，所形成的CpG ODN-SH-纳米金复合物在低剂量下的免疫刺激效果非常有限。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的未经修饰的CpG ODN易降解、摄取率低和需要高剂量重复给药，而修饰的CpG ODN具有各种副作用以及低剂量下免疫刺激效果低等问题。

本发明提供一种多价免疫刺激纳米制剂的制备方法，包括：（1）提供纳米金水溶液；（2）利用多聚腺苷酸修饰CpG ODN的3’端得到CpG ODN-polyA；以及（3）将所述CpG ODN-polyA组装到所述纳米金上形成所述多价免疫刺激纳米制剂。该制备方法简便快速、原料易得、成本较低且可重复性高。

在所述步骤（1）中，通过柠檬酸三钠水溶液还原氯金酸得到所述纳米金水溶液。该还原方法操作简便，工艺成熟。虽然在实施例中仅给出了15nm的纳米金水溶液的制备步骤，但是通过调节反应的条件，本领域的技术人员可以根据实际得到各种粒径的纳米金。

所述步骤（3）进一步包括：（3.1）将所述纳米金水溶液和所述CpG ODN-polyA混合均匀并震荡反应；（3.2）分批加入磷酸盐缓冲液，分离得到所述多价免疫刺激纳米制剂。磷酸盐缓冲液采用分批加入的原因是可以防止由于盐浓度的骤然增高而导致的纳米金的聚集，从而使得CpG ODN-polyA更为有效地结合到纳米金表面。