[发明专利]一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体及其应用方法

权利要求书

1.一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体，其特征在于步骤为：

1）查找pINA1296载体的启动子和终止子区域及构成载体的其它元件，其中利用的同尾酶分别加在启动子上游和终止子下游，然后设计4条引物（5'agcaccAAGCTTGCTAGCgccgccgcaaggaatggt 3'、5'gaattcGGATCCTCTAGAggacacgggcatctcacttgca3'、5'TCTAGAGGATCCgaattctcatgtttgacagcttatcatcg3'、5'GCTAGCAAGCTTggtgctcaacggcctcaacctac 3'），分别PCR扩增包括以启动子和终止子为区域的小片段及以载体的其他框架为区域的大片段，大片段和小片段大小分别为1065bp和6164bp左右通过PCR的方法获得两个大小不同的片段后，产物经过琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，再用DpnI 37°C消化3h以消除质粒背景，将两个片段混合通过无酶克隆的方式转化大肠杆菌XL10-Gold；

所述PCR方法的条件为98℃，2min，1 cycle; 98℃，7s，55℃，30s，72℃，1min, 30cycle；72℃，8min, 1 cycle；4℃保存；

2）转化的大肠杆菌XL10-Gold  37 °C生长12 h后，从平板随机挑取单菌落，小量提取质粒DNA与原始的pINA1296进行大小比对，初步确定为所需的重组子，命名为pINA1296I，该pINA1296I即为新改造构建的用于多拷贝解脂耶氏酵母表达载体；

3）验证重组是否成功。

2.一种离体高效构建多拷贝解脂耶氏酵母表达载体应用方法，其特征在于步骤为：

1）、选择需表达的目的基因xxx；

2）、重组含目的基因的质粒，首先，用限制性内切酶SfiI和限制性内切酶KpnI酶切pINA1296I载体，产物为含有粘性末端的线性片段，琼脂糖凝胶回收纯化酶切产物；其次，分别用限制性内切酶SfiI和限制性内切酶KpnI双酶切目的基因PCR产物，会产生与pINA1296I载体经酶酶切后互补的粘性末端，回收酶处理后的片段；最后，将双酶处理过的pINA1296I载体和目的基因片段混合，在16 °C条件下，用TaKaRa公司的连接酶试剂盒Solution I处理4 h后，转化大肠杆菌XL10-Gold，37°C培养过夜，挑取少量转化子抽质粒，进行大小比对和PCR鉴定，随挑选2个鉴定为阳性的重组子送测序，测序结果显示两个重组子序列都是正确的，该重组质粒命名为pINA1296I-xxx-A1；

3）、用常规方法检测表达能力：   

4）、利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因，在已构建好的单拷贝pINA1296I- xxx -A1载体基础上，将其分成3份，首先利用两对限制性内切酶HindIII，XbaI和NheI，BamHI酶切单拷贝pINA1296I- xxx -A1表达载体，分别切下两个小片段，即一个表达盒式结构的大小，再利用表达盒式结构最两端的限制性内切酶HindIII，BamHI酶切第3份pINA1296I- xxx -A1表达载体得到一个大片段作为载体，再将切下的两个小片段和一个大片段载体三者按3：3:1比例混合，16°CSolution I处理4 h后，转化大肠杆菌XL10-Gold，37°C培养过夜，将转化子命名为pINA1296I- xxx -A2，随机挑取几个转化子抽质粒与单拷贝pINA1296I- xxx -A1质粒进行大小比对；再用HindIII和XbaI限制性内切酶将pINA1296I- xxx -A2进一步酶切鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳图检测，与预期理论大小相符合，则两拷贝pINA1296I- xxx -A2载体构建成功，依此类推，在两拷贝pINA1296I- xxx -A2质粒的基础上，通过不断的酶切连接，转化及抽质粒比对大小，相应的找到三拷贝pINA1296I- xxx -A3和四拷贝pINA1296I- xxx -A4质粒，然后再酶切鉴定已构建的载体大小是否与理论值相符合。