[发明专利]一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法。

背景技术

人抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）浓缩物是从人血浆中分离纯化得到的血浆蛋白制品，主要用于治疗各种原因引起的抗凝血酶-Ⅲ缺乏症及手术造成的血栓等。目前，抗凝血酶-Ⅲ的纯化制备工艺以利用肝素亲和层析为主要步骤，在纯化的过程中，会发生层析填料中的肝素脱落，因此，要对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中的肝素含量进行检测。欧洲药典第7版（European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0）和美国药典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32）对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物的要求为每国际单位（IU）抗凝血酶-Ⅲ中肝素含量不超过0.1IU。

目前肝素的含量测定多采用凝固法和发色底物法，其检测基本原理均基于肝素与抗凝血酶-Ⅲ结合能够灭活凝血因子或抑制凝血反应。欧洲药典第7版中列出的抗凝血酶-Ⅲ中肝素测定方法有两种，一种为发色底物法，利用肝素-抗凝血酶复合物能够抑制活化的凝血因子Ⅹ水解发色底物的显色反应的基本原理，以已知含量肝素标准品作为参照，检测标准品及待测样品反应结果的吸光值（OD.405），通过绘制标准曲线计算待测样品中肝素的含量；另一种为凝固法，该方法是通过观察在一定条件下样品对血浆与高岭土、脑磷脂混合物复钙化后的抗凝作用（凝固时间），来判断待测样品的肝素含量。美国药典第32版对肝素含量的测定采用发色底物法，其原理与欧洲药典相同，但该法是以已知含量肝素和抗凝血酶-Ⅲ标准品的溶液作为标准溶液，待测样品肝素含量是通过与标准溶液反应结果比对得到。

凝固法操作复杂、耗时，发色底物法具有灵敏度高，操作简单、省时，检测所需试剂用量小等优点。在发色底物法中，绘制标准曲线计算结果的方式较采用的单一对比计算具有更高的稳定性和准确性。由于待测样品的特殊性，与肝素标准品相比，其含大量抗凝血酶-Ⅲ，在测定反应中会促进对凝血因子的灭活反应，进而影响测定结果的准确性。

中国药典（2010版）第三部中采用的肝素含量测定法为凝固法，以血浆与高岭土、脑磷脂混合物复钙化后的凝固反应为检测体系，利用硫酸鱼精蛋白能够中和肝素从而影响检测体系凝固时间为原理进行测定，但该方法并不适用于抗凝血酶-Ⅲ浓缩物。截至目前，还没有相关专门针对抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量检测方法的研究报道。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对以上所述测定技术中存在的样品抗凝血酶-Ⅲ的干扰大、测定准确性不高等技术问题，提出一种新的抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法。首先根据肝素具有比抗凝血酶-Ⅲ热耐受性高的特点，设计采用高温加热处理的方法使待测样品中抗凝血酶-Ⅲ失活，进而消除其对测定结果的影响；其次，采用微量发色底物法，通过绘制标准曲线，对待测样品肝素含量进行计算。

本发明所采用的技术方案为：

一种人抗凝血酶-Ⅲ浓缩物中肝素含量的测定方法，包括待测样品的处理、标准曲线的制作与样品的测定三个部分。其操作步骤为： 

1、待测样品的处理：

用0.02mol/L Tris缓冲液（pH8.4）将已知效价的抗凝血酶-Ⅲ浓缩物样品稀释至抗凝血酶-Ⅲ浓度为1IU/ml，60~80℃高温水浴处理20~50min。

2、标准曲线的制作与样品的测定：

（1）用Tris缓冲液pH8.4将已知效价的肝素标准品稀释至0~0.1IU/ml的已知浓度，作为标准溶液；

（2）取四种或四种以上不同浓度肝素标准溶液及处理后的待测样品溶液一定体积于微孔板不同孔中；

（3）每孔加入等体积0.5~2.0IU/ml 抗凝血酶-Ⅲ标准溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（4）每孔加入等体积活化的牛凝血因子Ⅹ溶液即牛FⅩa溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（5）每孔加入等体积发色底物N-α-苄氧羰基- D-精氨酰- L-甘氨酰-L-精氨酸-P-硝基苯胺的盐酸盐溶液即S-2765溶液，混合均匀，37℃孵育2分钟；

（6）每孔加入适量乙酸，混合均匀终止反应；

（7）将微孔板直接在酶标仪上于波长405 nm处读取吸光值；

（8）根据肝素标准溶液浓度与测得的相应吸光值绘制标准曲线；

（9）以待测溶液反应产物吸光值根据标准曲线计算每国际单位人抗凝血酶-Ⅲ溶液中肝素的含量。