[发明专利]一种特异抗人肺特异X蛋白的单克隆抗体的制备、鉴定及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株特异性抗人肺特异X蛋白(LunX蛋白)的单克隆抗体。具体地说，本发明涉及一株特异性针对人LunX蛋白第103至256位的氨基酸序列的单克隆抗体，本发明还涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及所述单克隆抗体的应用。 

背景技术

在全球范围内，肺癌是近年来发病率最高的恶性肿瘤之一，其发病率上升速度是最快的。肺癌5年存活率为13％；80％的患者在诊断后1年内死亡；肺癌早期诊断率为15％，但这些患者5年存活率达到60％～90％。由此可见，亟待寻找肺癌的早期诊断和治疗的靶点。目前国际上倾向于将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占肺癌的85％以上。 

肺特异X蛋白(简称LunX蛋白)，又称：PLUNC；NASG；SPURT；LPLUNC3；SPLUNC1。其基因是日本学者Iwao等通过对人体13种不同组织中分离出来的RNA运用差异显示技术，于2001年发现的一种人肺组织特异性X蛋白。基因定位于20p11.1q12，全长1015bp，包括一个编码256个氨基酸的768个核苷酸的开放式读码框。其含有和LPS结合的BPI样结构域，所以认为LunX蛋白是一个参与天然免疫的天然免疫分子。目前其主要研究集中于上呼吸道，当感染时上皮细胞等LunX蛋白表达升高，而正常肺实质细胞不表达LunX蛋白，但伴随癌变开始高表达。 

由于LunX蛋白在肺癌病人中表达的特异性，因此，准确快速检测组织局部LunX蛋白表达以及探讨以LunX作为靶标的生物治疗具有重要的临床意义。 

发明内容

发明概述 

本发明的一个目的是提供对人LunX蛋白有特异性的单克隆抗体。 

本发明的又一个目的是提供产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株LunX-mAb-S-35-8。 

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体的制备方法。 

本发明的又一个目的是验证本发明的单克隆抗体在体外能够抑制肺癌细胞的增殖，在体内可以抑制肿瘤的生长，并且在体内可以抑制肿瘤的生长及转移。 

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体在免疫组织化学检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者的肺组织中LunX蛋白表达试验中的应用。 

本发明的又一个目的是提供本发明的单克隆抗体在细胞免疫荧光检测NSCLC患者的锁骨下淋巴结中LunX蛋白表达试验中的应用。 

有益效果：本发明提供了一株特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体、其制备方法、鉴定及应用，所述单克隆抗体特异性好，灵敏度高，能够应用于检测人肺脏组织和淋巴结LunX蛋白的表达，可以作为肺癌的早期或转移的诊断指标之一，另外，本发明的单克隆抗体可以抑制肿瘤的生长及转移。因此，本发明对肺癌的诊断及治疗具有重大的临床意义。 

发明详述 

本发明的第一方面涉及一种特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体，该抗体的类型为IgG_2b，κ，其特异性针对的是人LunX蛋白的第103-256位的氨基酸序列。 

本发明的第二方面涉及稳定分泌所述抗人LunX蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LunX-mAb-S-35-8，该细胞株已于2012年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：C2012187。 

本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体在本文中也可以称为单克隆抗体S-35-8。 

本发明的第三方面涉及所述单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：重组人LunX蛋白的表达、复性与纯化，用纯化后的人LunX蛋白免 疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合，筛选出能够稳定分泌对重组人LunX有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清中或者从用该杂交瘤细胞免疫的小鼠腹水中获取单克隆抗体。 

本发明的第四发明涉及本发明的特异性抗人LunX蛋白的单克隆抗体的功能鉴定： 

S-35-8单克隆抗体能够在体外抑制NCI-H292细胞的增殖，将本发明的S-35-8单克隆抗体加入NCI-H292细胞培养上清中，细胞计数实验显示：S-35-8单克隆抗体能够抑制NCI-H292细胞的增殖； 

S-35-8单克隆抗体能够在体内抑制移植性肿瘤(移植性肿瘤：人肺癌细胞系NCI-H292细胞接种于裸鼠皮下)的生长，肿瘤大小测量结果显示：S-35-8单克隆抗体能够抑制肿瘤的生长；