[发明专利]一种磷酸肌酸钠的制备方法

权利要求书

1.一种制备磷酸肌酸钠的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）分别构建肌酸激酶和乙酸激酶表达菌株，诱导表达并进行破碎处理；

（2）采用特异性金属螯合亲和纯化方法制备高纯度的肌酸激酶和乙酸激酶；

（3）将肌酸激酶和乙酸激酶共固定至载体颗粒上，形成共固定化酶；

（4）共固定化酶催化反应生成磷酸肌酸钠；

（5）离子交换树脂分离纯化磷酸肌酸钠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）为分别合成肌酸激酶基因和乙酸激酶基因，将肌酸激酶基因和乙酸激酶基因分别连至克隆载体上，转化大肠杆菌，筛选得到正确的克隆载体，并分别构建含肌酸激酶基因和乙酸激酶基因的表达载体，然后分别将这两种重组载体通过化学转化或电转化的方式转入表达型大肠杆菌，构建表达型大肠杆菌重组菌，诱导表达并进行破碎处理；

其中，所述肌酸激酶基因是兔肌肉型、兔脑型、牛线粒体型、人杂化型或人线粒体型的肌酸激酶基因；

所述乙酸激酶基因是反刍月形单胞菌K6、埃氏巨型球菌、保加利亚乳杆菌或者Marinithermus hydrothermalis DSM14884的乙酸激酶基因；

所述克隆载体为pBluescript系列或pUC19；所述表达载体为pET22、pET28、pET15或pET43；

所述大肠杆菌为DH5α、Top10或JM109；所述表达型大肠杆菌为BL21（DE3）。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述肌酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述乙酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）为利用特异性金属螯合亲和层析柱纯化破碎的大肠杆菌重组菌菌液，菌液以25-45BV/h的流速过柱，以30-50BV/h流速洗脱，洗脱液经除盐处理后得到纯化的肌酸激酶和乙酸激酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）为将纯化后的肌酸激酶、乙酸激酶与固定化载体颗粒按1000-5000U:1200-6800U:50-250g比例进行混合，进行固定化反应，固定化过程中加入硫酸铵固体粉末至终浓度250-350mM，固定化温度为15-35℃，时间为10-50h，固定化过程中控制pH值为5.5-6.5。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述固定化载体颗粒为环氧型树脂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）为配制共固定化酶催化反应的反应物溶液，所述反应物溶液中ATP浓度为10-50mM，肌酸浓度为ATP浓度的1-5倍，镁离子浓度为ATP浓度的1-5倍，乙酰磷酸浓度为ATP浓度的1-5倍，加入缓冲体系使反应物溶液的pH值为8-10，再加入100-500g的共固定化酶颗粒，催化反应的温度为25-45℃，反应过程中不断滴入稀碱以维持pH在8.0-9.0，当反应溶液的pH值不再变化时停止反应，筛网过滤分离共固定化酶颗粒和反应后的溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系为Gly-NaOH缓冲体系或Na₂B₄O₇-NaOH缓冲体系。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）为将离子交换树脂填装层析柱，步骤（4）反应后的溶液以6-10BV/h的流速过柱，以6-10BV/h的流速洗脱。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述树脂为Amberlite IRA900，D201，D301树脂中的一种。