[发明专利]一种重组甘露聚糖酶及其基因工程菌和水解制备甘露寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码重组的β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株的构建以及利用毕赤酵母表达甘露聚糖酶的方法，同时，利用该重组甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖制备甘露寡糖的方法，在工业生产中无需调节PH，操作简单，能够降低生产成本，缩短工艺流程，简化后续处理步骤。 

背景技术

甘露低聚糖是由2一10个单糖分子通过糖苷键连接而成的低度聚合糖，可以有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道有益菌群的特异性增殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿癌及增强机体免疫力等多种生理功能。此外，低聚甘露糖还具有不被人体降解、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，是新一代功能性食品。 

近年来，关于低聚糖的研究越来越多，已有多种功能性低聚糖产品投入市场，但目前大多数低聚糖产品属于普通型的低聚糖，有效成分不足50％。欧美等国因限于资源，主要采用化学合成方法和从酵母细胞壁分离提取甘露低聚糖，其中酵母发酵法成本低，污染少，但它们的产品纯度低、性能差。为了提高产品纯度，必须在后续工艺中使用操作复杂成本过高的提纯工序，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法等。酵母发酵法生产的关键是甘露聚糖酶。如何寻找高活力的甘露聚糖酶，使水解的效率提高，使产品的纯度提高，使后续提纯工序简单有效，能低成本地生产高纯度低聚糖，显得尤为重要。 

甘露聚糖酶，是一类能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶，能水解植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶和魔芋等)生成低聚甘露糖。甘聚聚糖酶广泛存在于自然界中，在动物、植物和微生物体内有该酶的存在，而微生物是其主要来源。芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌、真菌中的曲霉、青霉、酵母菌和放线菌中的链霉菌都是产甘露聚糖酶的常见菌群。国内现在有许多相关科研单位，如中科院微生物研究所，南开大学等广泛进行了甘露聚糖酶及其相关内容的研究，但所报道的发酵酶活性不高，酶解产物纯度低，生产成本高，难以工业化。 

魔芋是我国南方地区的特有经济作物，其主要成分为葡甘聚糖，在西南贫困山区产量很高，目前在国内主要作为一种粗纤维食粮或作为食品添加剂，附加值不高。将魔芋利用甘露聚糖酶经酶法水解制成甘露低聚糖，有很好的市场前景。在生产中的一般甘露聚糖酶活性差，水解效率低，底物浓度低，不能适应生产的要求。 

发明内容

本发明的目的是运用基因工程手段寻找毕赤酵母偏爱密码，构建重组的β-甘露聚糖酶基因，实现甘露聚糖酶的高效稳定表达，同时利用表达的重组β-甘露聚糖酶水解高浓度甘露聚糖制备甘露寡糖。 

本发明是这样实现的。本发明的步骤为： 

一、重组β-甘露聚糖酶基因的合成 

在氨基酸序列不改变的前提下，对原始的β-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列利用DNAWORKS工具进行优化，优化后的基因全部由毕赤酵母偏爱密码组成。优化后的核苷酸序列与原始基因的核苷酸序列(GeneBank^TM accession XM_001390670.1)相比，有257个核苷酸发生变化，核苷酸的同源性为76％。同时为了使β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中能够高效稳定的分泌表达，优化后的β-甘露聚糖酶基因少了编码5’端信号肽序列的20个氨基酸。 

优化前的序列： 

atgaagcttt ccaacgccct cctcaccctg gctagcctgg cgctggccaa cgtctccacg 60 

gctctgccga aagcctcccc tgcaccgagc accagcagca gtgctgcctc cacctccttc 120 

gccagcacct ccggcctcca attcaccatt gatggcgaaa ctggctactt cgccggaacg 180 

aacagctact ggatcggttt cctcactgac aacgcggacg tcgacctcgt catgggccac 240 

ctgaagtcgt ccggcctcaa gatcctccgc gtgtggggct tcaacgatgt cacctcgcag 300 

ccctcctccg gcacagtctg gtaccaactg caccaggacg gcaaatcgac aatcaacacg 360 

ggtgccgacg gtctccagcg cctcgactac gtcgtctcgt ctgccgaaca gcacgacatc 420