[发明专利]一种汉逊酵母表达系统及其构建方法和应用

权利要求书

1.一株多型汉逊酵母菌（Hansenula polymorpha）AU-0501，其为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断，其保藏编号为CGMCC No.7013。

2.权利要求1所述的多型汉逊酵母菌AU-0501在生产外源蛋白中的应用。

3.含有权利要求1所述多型汉逊酵母菌AU-0501的汉逊酵母表达系统。

4.一种构建尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以汉逊酵母野生型宿主菌基因组DNA为模板，分别以引物P1和P2进行PCR扩增获得Ura3的5’端基因片段，以引物P5和P6进行PCR扩增获得Ura3的3’端基因片段；以Pichia pastoris表达载体pPIC9K为模板，以P3和P4为引物进行PCR扩增获得G418基因片段；所述引物P1~P6的核苷酸序列如SEQ ID NO.13~18所示；

（2）将上述三个基因片段进行纯化，以纯化好的Ura3的5’端基因片段、G418基因片段、Ura3的3’端基因片段为模板，以引物P1和P6进行PCR扩增获得U5’-G418-U3’基因片段，将纯化获得U5’-G418-U3’基因片段通过电穿孔转化到汉逊酵母野生型宿主细胞中，U5’-G418-U3’基因片段通过同源重组方式整合于汉逊酵母野生型宿主细胞中；

（3）将转化后的细胞涂YPD+G418固体培养基于37℃培养箱培养至长出菌落；挑选菌落依次转接到YNB选择性固体培养基、YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上置37℃培养箱培养，挑选在YNB+尿嘧啶固体培养基、YPD+G418固体培养基上均生长而在YNB选择性固体培养基上不生长的菌落即为汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述汉逊酵母野生型宿主菌为汉逊酵母ATCC26012。

6.一种应用于汉逊酵母表达系统启动外源基因表达的载体，其为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，通过如下方法制备获得：

（1）以汉逊酵母基因组DNA为模板，分别以引物MOXP-F、MOXP-R；MOXT-F、MOXT-R；HARS-F、HARS-R（见SEQ ID NO.8）；Ura3-F、Ura3-R进行PCR扩增，获得基因MOXP、MOXT、HARS、Ura3；上述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3~10所示；

（2）以PBR-SK质粒为模板，以引物Amp+ColE1-F、Amp+ColE1-R进行PCR扩增，获得基因Amp+ColE1，上述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11~12所示；

（3）将以上5个基因片段纯化，取纯化好的MOXP、MOXT基因片段作为模板，以引物MOXP-F和MOXT-R进行PCR扩增获得MOXP+MOXT基因片段；分别取纯化好的HARS、Ura3、Amp+ColE1基因片段各1μl作为模板，以引物HARS-R和Amp+ColE1-R进行PCR扩增获得HARS+Ura3+Amp+ColE1基因片段；将基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1进行纯化，将纯化好的基因片段MOXP+MOXT、HARS+Ura3+Amp+ColE1用SacI、SalI分别进行双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切基因片段，连接，将连接后的重组表达载体转化感受态细胞中，转化克隆筛选得到重组表达载体PMV-05。

8.权利要求6或7所述载体在表达外源蛋白中的应用。

9.一种汉逊酵母表达系统，其特征在于，包括启动外源基因表达的载体和具有特定筛选标记的宿主细胞，所述宿主细胞为尿嘧啶缺陷型汉逊酵母菌，其乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被阻断；启动外源基因表达的载体为PMV-05，其含有启动子MOX-P、终止子MOX-T、复制子HARS、ura3基因、ColE1复制子、Amp抗性基因。

10.权利要求9所述的汉逊酵母表达系统在生产类病毒颗粒疫苗中的应用。