[发明专利]一种MDCK细胞制备流感疫苗的培养基及其使用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品领域，涉及一种培养基的配置和使用方法，更具体的，涉及一种用于在大规模高密度生长环境的培养MDCK细胞制备流感病毒疫苗的培养基。

背景技术

通过动物细胞培养以制备最终产品，是生物制品领域最常用的生产方式之一。用于动物细胞培养的培养基，绝大部分需要加入10％-15％的动物血清，以提供细胞生长所需的营养成分及细胞保持正常形态的支持蛋白。但是，来源于动物的血清的缺点在于：成分难以明确，产品批间差异不易控制，价格昂贵，并且要求极其严格的检测程序以确保血清中不含有血清来源动物可能携带的细菌、病毒等。MDCK细胞广泛用于生物制品领域，尤其是疫苗制备。使用MDCK细胞制备流感疫苗是近年来流感疫苗生产的一个新趋势。生物反应器及多种适合的载体，已被广泛应用于动物细胞培养，其优点在于，许多种类的生物反应器可以通过灌流培养的方式实现大规模，高密度培养动物细胞。为达到良好的培养效果，生物反应器的参数设置和所选培养基的成分是其中的重要因素。然而，针对使用生物反应器大规模高密度培养MDCK细胞制备流感疫苗的培养基研究有待深入进行。

发明内容

本发明提供一种适用于大规模高密度培养MDCK细胞制备流感疫苗的培养基及其使用方法。使用本发明所述的培养基，使MDCK细胞的大规模高密度培养在低血清浓度条件下进行。接种流感病毒后，使用本发明所述的无血清、低蛋白的培养基用来维持病毒在细胞液中的增殖。本发明提供的培养基及其使用方法，使MDCK细胞高效贴附在微载体上，细胞生长过程中生长速度快，细胞形态好，在灌流培养方式下可以在3-5天内达到极高密度；接种流感病毒后，在维持培养基培养下，可以连续收获病毒液7-10天。

本发明的一种大规模高密度培养MDCK细胞制备流感疫苗的培养基，其组成成分及重量份为：

上述培养基的组成成分及重量份优选为：

上述培养基，在使用前加入3％-5％的胎牛血清或小牛血清，经过膜过滤制成在大规模高密度环境下使用的培养MDCK细胞的培养液。

本发明的一种大规模高密度培养得到MDCK细胞接入流感病毒后，维持病毒感染时期的培养基，其组成成分及重量份为：

上述培养基的组成成分及重量份优选为：

上述培养基还包含如下成分及其重量比例：

上述培养基包含的添加成分，其重量份的优选比例为：

所述大规模高密度培养MDCK细胞所用的生物反应器可使用本领域常用的内部结构支持使用载体的各类生物反应器，例如德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Satorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器生物反应器，杭州安普公司生物反应器，上海日泰公司生物反应器，广州旗帜公司生物反应器。优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器，德国Satorious公司生物反应器，荷兰Applicon公司生物反应器，更优选使用德国Eppendorf(艾本德)公司New Brunswick Scientific生物反应器。

所述载体可选自常规使用的各种材料制的载体，包括化工材料的聚丙烯，PLA，PGA，多孔硅，PLGA，PPF等，和天然材料的葡聚糖，胶原蛋白，琼脂，谷物蛋白等。优选使用葡聚糖材料的微载体，更优选使用美国GE公司Cytodex1球形微载体。

所述MDCK细胞培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：37摄氏度，溶氧DO为30-50％，按比例通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.0，转速为110rpm。

接种流感病毒种毒液，使用病毒液维持培养基时，培养的条件是本领域中常规的使用条件，生物反应器的参数设置参考生物反应器厂家的使用说明书设置。优选的培养条件是：36摄氏度，溶氧DO为50-70％，通入压缩空气，氧气，二氧化碳和氮气四种气体，通气量为1.2，转速为110rpm。