[发明专利]一种测定丙胺酰谷氨酰胺含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及色谱分析领域，具体地说是一种丙胺酰谷氨酰胺注射液生产过程中利用柱后衍生化高效液相色谱法测定丙胺酰谷氨酰胺的方法。

背景技术

N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(alanylglutamine dipeptide，Ala-Gln)，作为谷氨酰胺(glutamine，Gln)的供体，弥补了Gln不足，扩大了其在临床上作为静脉营养制剂的应用范围。丙氨酰谷氨酰胺是肠外营养的一个组成部分，适用于需要补充谷氨酰胺的病人，包括处于分解代谢和高代谢状况的病人。

分子式：C₈H₁₅N₃O₄，分子量：188.18

现有技术中，高效色谱法是测定丙胺酰谷氨酰胺的重要测定方法之一，如，国家食品药品监督管理局标准YBH06582005，使用以氨基键合硅胶为填充剂；乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.0)(65∶35)为流动相；检测波长为215nm。文献“柱前衍生化HPLC法测定N(2-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺注射液的含量”(《中国生化药物杂志》，2006，27(6)364-369)选用乙腈-0.1mol/L的醋酸钠溶液(用稀醋酸调整pH5.50)＝44∶56作为流动相，柱温30℃，检测波长为254nm进行含量的检测分析；及文献“茚三酮柱前衍生法测定丙氨酰谷氨酰胺的含量”(《中国现代应用药学》，2011，07，669-670)采用磺酸基强酸性阳离子交换树脂PEEK(4.6mm×150mm)，流动相为钠钾缓冲液，流速0.45ml/min，茚三酮溶液流速为0.25ml/min。一方面，由于丙氨酰谷氨酰胺的稳定性较弱，利用上述三种流动相进行测定时，分离效果差或者出峰时间晚，不利于丙氨酰谷氨酰胺的含量控制；另一方面，在国家国家食品药品监督管理局标准YBH06582005中丙氨酰谷氨酰胺的峰形较差，在检测时有一定的误差，且时间较长。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供一种丙胺酰谷氨酰胺注射液生产过程中利用柱后衍生化高效液相色谱法测定丙胺酰谷氨酰胺的方法。

本发明的技术任务是按以下方式实现的：一种测定丙胺酰谷氨酰胺含量的方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，以有机相与磷酸盐缓冲溶液为水相的混合溶剂作为流动相，用异硫氰酸苯酯、三乙胺、无水乙醇、超纯水的混合液为衍生试剂，

所述有机相为乙腈或甲醇；

所述磷酸盐缓冲溶液由以下方式制得：将三乙胺5ml加水至1000ml，且用磷酸调节pH在5.0-6.0之间；

流动相中，水相的体积百分比为30％～50％。

为了达到最好的测定效果，测定时的柱温优选为30～40℃。

所述衍生试剂优选为400ml异硫氰酸苯酯、400ml三乙胺、2800ml无水乙醇及400ml超纯水的混合液。

1)取丙氨酰谷氨酰胺适量，加有机相溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的样品溶液，作为供试品溶液；

2)设置流动相流速为0.8～1.2ml/min，优选为1ml/min；检测波长245nm；选用C18柱，以异硫氰酸苯酯400ml，三乙胺400ml，无水乙醇2800ml，超纯水400ml，混匀，为柱后衍生试剂，调整流速为0.25ml/min。；

3)取1)的供试品溶液10～50μl，优选20μl，注入高效液相色谱仪，完成丙氨酰谷氨酰胺的测定。

与现有技术相比，本发明方法的洗脱分离效果较好，能较好的使本品与杂质色谱峰分离且分离度较好，出峰时间合适，能够有效测定丙氨酰谷氨酰胺的含量，无需提前处理样品，方法简单快捷，分析灵敏度高，结果准确可靠。可用于丙氨酰谷氨酰胺的质量控制。

附图说明

附图1是利用本发明实施例一测定结果的色谱图；

附图2是利用本发明实施例二测定结果的色谱图。

具体实施方式

参照说明书附图以具体实施例对本发明的测定丙胺酰谷氨酰胺含量的方法作以下详细地说明。

实施例1

仪器与条件

高效液相色谱仪：Waters2695泵；Waters2487紫外检测器

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250mmx4.6mm，5μm)

流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.0)(65∶35)等度洗脱

流速：1.0ml/min