[实用新型]大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒

说明书

技术领域

本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。

背景技术

在凝血过程中，内源性和外源性凝血途径通过不同的启动和反应方式激活凝血因子X转变为Xa，Xa可使凝血酶原分子中的Arg(280)-Tyr(281)及Arg(316)-Ile(317)间的肽键同时断裂，释放出凝血酶原片段F1+2，即Al a(4)-Arg(323)，同时C端释放出由轻链A和重链B组成的丝氨酸蛋白酶，即凝血酶。该凝血酶能够反馈裂解酶原本身，释放出片段1(F1)和片段2(F2)，序列分别为Ala(1)-PHe(157)，Ser(158)-Arg(180)。因此血液中F1+2的含量可较灵敏的反应出凝血酶原活化的状态，可作为对高凝状态及抗凝和溶栓治疗进行监测的分子标志。临床上在深静脉血栓形成、肺栓塞、弥散性血管内凝血、溶栓治疗、白血病患者体内F1+2明显增高，而在口服抗凝剂治疗患者体内该指标显著降低。

大鼠作为生物医学实验中常用的动物模型，广泛应用于基础医学领域各项生理病理机制、药物以及物理治疗方法的研究中，但是目前没有针对大鼠F1+2检测的ELI SA试剂盒，因此有必要制备高灵敏度、特异性的产品。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的待测物，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。

因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行大鼠凝血酶原片段F1+2的检测。

实用新型内容

本实用新型目的是提供一种大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案：

本实用新型一方面涉及大鼠凝血酶原片段F1+2酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于：所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的包被层含有兔抗大鼠F1多克隆抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。

在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。

本实用新型的试剂盒特异性、精确度、灵敏度均较高，可以满足普通实验室的要求。

附图说明

图1为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。

1固相载体，2包被层，3封闭层。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。

本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫分析法测定大鼠血浆样本中F1+2的水平。制备过程如下：使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的兔抗大鼠F1多克隆抗体，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。由此可见，该酶标板微量孔内主要有2层：2，包被层；3，封闭层。试剂盒的检测抗体，即检测液A，为生物素化的兔抗大鼠F2多克隆抗体，并以亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)作为检测液B，与检测抗体特异性结合。其余试剂盒组份包括重组蛋白F1+2制备的标准品、底物TMB和终止液。

1.重组蛋白的获得：重组F1和F2将作为免疫原免疫动物获得抗体，凝血酶原将用作F1和F2抗体的反向筛选，而重组F1+2将用作ELI SA试剂盒的标准品。

1)引物设计与PCR扩增

参照GenBank公布的大鼠凝血酶原(Prothrombin)基因序列(NM_022924.2)，分别设计扩增F1(氨基酸序列1A-157R)、F2(氨基酸序列158S-323R)、F1+2(氨基酸序列1A-323R)及凝血酶原的特异性引物，并用特异性条件扩增。

A.F1上游引物：5’-GCGCGAATTCGCCAACAGCGGCTTCCTG-3’(EcoR I)