[实用新型]一种木材中松材线虫核酸快速提取装置

说明书

技术领域

本实用新型属于分子生物学技术领域，具体涉及一种木材中松材线虫核酸快速提取装置。 

背景技术

目前检测松材线虫方法主要有以下几种： 

（1）形态学鉴别法：将疑似染有松材线虫的木材用刀具劈开成小条状，然后将条状木材置于下部漏斗状玻璃容器中，在玻璃器皿的下部漏斗出口处套一根橡皮管，在管上加一弹簧夹夹紧，在玻璃容器中加水使木条浸满，静止数天，使松材线虫从木材中游离到水中并沉入到漏斗出口处，放开弹簧夹将底部含虫的水放入玻璃皿内，在显微镜下观察，以形态学特征诊断松材线虫。此法的最大缺点是，耗时长、效率低、形态学鉴别具有不确定性。在日本，Mamiya等早在1979年就提出了采用尾部的尾尖突来区分松材线虫和拟松材线虫，这也是目前两种线虫鉴别中的主要形态学依据。由于北美的松材线虫有些群体中的雌虫尾部也有尾尖突，因此从形态上要将两者正确区分开来对一些非专业从事植物线虫分类的人员是非常困难的。

（2）酶测定法：谷氨酸草酰乙酸转氨酶是可区分两种线虫的酶，松材线虫分泌的纤维素酶的谱带类型与拟松材线虫的纤维素酶的不同，酯酶同功酶和苹果酸脱氢酶谱，也可以区别松材线虫和拟松材线虫。由于酯酶的稳定性并不好，同一株系在不同菌上培养后也有变化。这可能与酶本身易受外界环境条件如培养线虫的条件(湿度和温度等) 、提取过程及提取物的贮藏条件、分析方法及线虫本身即线虫的各发育阶段或在某一阶段线虫的生理状况的影响有关。因此，酶虽然在密切相关的种类间保持着高度保守性，但由于上述因素，利用电泳分析线虫蛋白易导致结果的不稳定性。该方法复杂、繁琐、不稳定、特异性差，无实际应用价值。 

（3）免疫学方法：主要有多克隆抗体和单克隆抗体技术，用多克隆抗体酶联免疫法测定，虽然EL ISA的敏感度高，但种间区分度并不好，这跟多克隆抗体的特异性差有关。用单克隆抗体方法在一些重要的植物寄生线虫的鉴定中已有成功先例，如Arjen Schots等应用单克隆抗体技术区分出马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.pallida)，其他如大豆孢囊线虫(Het2erodera glycines)和南方根结线虫(M. incog2nita)也有过单克隆抗体技术的应用。 

（4）激素测定法：松材线虫与拟松材线虫产生的性外激素具有种特异性，即松材线虫或拟松材线虫只有各自的雌虫才能吸引各自相应的雄虫，这是各自雌虫释放性外激素引起的反应。因此可利用测定性外激素来区分两者。松材线虫与拟松材线虫产生的性外激素具有种特异性，即松材线虫或拟松材线虫只有各自的雌虫才能吸引各自相应的雄虫，这是各自雌虫释放性外激素引起的反应。因此可利用测定性外激素来区分两者。 

（5）脂类测定方法：Krusberg等(1973)报道，南方根结线虫和花生根结线虫的成熟雌虫和卵的脂肪酸性质相同，但是两种线虫中某种脂肪酸的含量不同，因此可以以此来区分两种线虫。但目前尚未见有用脂类来区分松材线虫与拟松材线虫的报道，在这方面是否可行，也可进行一番尝试。 

（6）核酸测定法：随着近几年分子生物学技术的迅猛发展，以DNA为基础的诊断，在线虫分类鉴定中的作用与日俱增，在许多植物线虫类群中已建立了较成熟的分子诊断系统。目前已经有比较成熟的PCR和RT-qPCR的试剂盒供应。 

在核酸测定法中，从生物中提取核酸的方法甚多，目前提取核酸的方法主要有以下几种： 

（1）有机提取法。基本原理：苯酚使蛋白变性，SDS裂解细胞膜，蛋白酶K和EDTA消化蛋白或多肽或小肽，核蛋白变性降解使DNA从核蛋白中游离出来。利用DNA易溶于水，不溶于有机溶剂的特性提取DNA。

（2）螯合树脂法。基本原理：以主要使用的螯合树脂chelex-100为例，其含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸下可以使细胞膜裂解，并使蛋白变性，DNA游离。 

（3）无机提取法。基本原理：利用NaCI或醋酸钠沉淀蛋白，经离心，用无水乙醇沉淀提取DNA。 

（4）差异裂解提取法。基本原理：利用某些生物样本的细胞膜易于破碎，另一些生物样本的细胞不容易破碎的特点，使用常规方法先去除易于破碎细胞，再用特殊试剂裂解不容易破碎细胞，再提取其中的DNA。 

（5）磷酸盐缓冲液法。基本原理：细胞在含非离子去垢剂和蛋白酶K的溶液中消化后，高温加热使蛋白质及蛋白酶K失活，离心沉淀分离蛋白质，从离心上清液中提取DNA。