[发明专利]用于悬液细胞培养的方法和系统

说明书

相关申请

此专利文件根据法条35U.S.C.§119(e)，要求2011年1月5日提交的美国临时专利申请61/429,931的优先权，该申请的内容在此通过引用的方式并入本文。

背景技术

生产基于重组蛋白的生物药品是一项复杂且劳动和资本密集的尝试。目前，哺乳动物细胞被应用于大多数人蛋白的制造中。典型的哺乳动物细胞含有大量转译后修饰内容，此类修饰无法由无修饰原核细胞和无修饰单细胞真核生物完成。虽然如中国仓鼠卵巢细胞和仓鼠崽肾细胞一类的哺乳动物细胞能够忠实地完成大多数人蛋白的生物合成，其效率却远远低于细菌或酵母细胞能达到的程度。

目前市场销售的重组蛋白之中，fVIII的生产效率最为低下，也是目前每单位质量成本最高的(图1)。重组fVIII是X-染色体相关的先天出血性疾病血友病A的首选治疗方案。该治疗方案包括每周2-3次fVIII静脉注射，花费为每年约100,000-300,000美元(Bohn RL,Avorn J,Glynn RJ,Choodnovskiy I,Haschemeyer R,Aledort LM.Prophylactic use of factor VIII:an economic evaluation.Thromb Haemost.1998;79(5):932-7,在此全文引述)。因此，全世界仅有不到三分之一的血友病A患者能够得到此项治疗。有史以来，fVIII一直供不应求，价格也由于高昂的研究、开发和制造成本而一直过高。要改善血友病A及其他可采用蛋白替补疗法的单基因疾病的治疗条件，一种方法是开发生产效率更高的重组蛋白制造方法。

当代最先进的重组h-fVIII制剂一般以哺乳动物细胞，如BHK-21或中国仓鼠卵巢细胞，以大规模发酵生物反应器进行生产。可通过若干技术最大化重组h-fVIII的产量，包括(1)以DHFR/甲氨蝶呤选择法扩增h-fVIII转基因；(2)向培养基中加入fVIII稳定剂(例如：牛/人血清蛋白或利用vWf共表达),以及(3)以连续注入式发酵令细胞生长率/密度最大化。然后，通过一系列过滤、免疫亲和性、分子排阻及离子交换色谱步骤，将fVIII从条件培养基提纯。通常，还要在提纯流程中加入病毒灭活步骤来提高安全性。一旦经过提纯，就可以依照配方向fVIII材料中加入稳定剂，干燥冷冻，然后进行包装。这一标准化的制造过程已在Boedeker BG.Production processes of licensed recombinant factor VIII preparations.Semin Thromb Hemost.2001;27(4):385-94中论述，在此全文引述。

第一代重组fVIII制剂以人血清蛋白作为稳定剂，但后者理论上可能携带病毒污染物。为了减少病毒污染物的风险，出现了被认为是“不含动物制品”的第二代和第三代的fVIII制剂，以蔗糖和其他添加物作为稳定剂。由于认为新生代重组制剂比血浆源性制剂和第一代制剂具有较高的安全性，许多已接受过治疗和大多数尚未接受治疗的病患都转向了第二代和第三代fVIII制剂。这样的需求导致了数次fVIII制剂短缺，也催生了暂时性定量配给fVIII制剂的应对方针(Garber K.rFactor VIII deficit questioned.NatBiotechnol.2000;18(11):1133,在此作为参考文献引述)。

若干论文表明，重组人体fVIII的标准生产水平为<1单位/10⁶个细胞/天(Kaufman RJ,Pipe SW,Tagliavacca L,Swaroop M,Moussalli M.Biosynthesis,assembly and secretion of coagulation factor VIII.Blood CoagulFibrinolysis.1997;8Suppl2:S3-14.:S3-14,在此作为参考文献引述)。典型情况下，重组人体fVIII制剂成品的比活性为4000-10,000单位每毫克蛋白，而一名体重70kg的成人一次治疗的花费在2,500–5,000美元。目前，fVIII制剂具有60-80亿美元的年需求，然而事实上，该产品只能满足不到三分之一的潜在全球市场。

附图说明

图1为目前生物制药制造业的格局图示;

图2展示了从BHK-M细胞到BHK-Ms细胞的转变；BHK-M细胞适于利用一种未授权专利方法来实现悬浮，该方法包括贴壁BHK-M细胞的连续重复接种;