[发明专利]发酵制备含硫氨基酸的方法

权利要求书

1.发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法，包括步骤：

a)提供与特定起始菌株相比具有增加的硫代硫酸硫转移酶活性的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)微生物或棒杆菌科(Corynebacteriaceae)微生物；

b)在含有无机硫源的培养基中发酵来自a)的微生物，获得发酵液，所述无机硫源来自二硫代硫酸盐或者二硫代硫酸盐和硫酸盐的混合物；和

c)浓缩来自b)的发酵液中的含硫氨基酸。

2.发酵制备选自L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-高半胱氨酸和L-高胱氨酸的含硫氨基酸的方法，优选根据权利要求1的方法，包括步骤：

a)提供过表达编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的肠杆菌科微生物或棒杆菌科微生物；

b)在含有无机硫源的培养基中发酵来自a)的微生物，获得发酵液，所述无机硫源来自二硫代硫酸盐或者二硫代硫酸盐和硫酸盐的混合物；和

c)浓缩来自b)的发酵液中的含硫氨基酸。

3.根据权利要求1或2的方法，特征在于所述微生物过表达一或多个编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因，所述具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽选自下列a)至d)：

a)由多肽Rdl2p、GlpE、PspE、YgaP、ThiI、YbbB、SseA、YnjE、YceA、YibN、NCgl0671、NCgl1369、NCgl2616、NCgl0053、NCgl0054、NCgl2678、NCgl2890；来自哺乳动物的硫代硫酸硫转移酶，例如来自牛肝(Bos taurus)的硫代硫酸硫转移酶；优选Rdl2p、GlpE、PspE，且特别优选Rdl2p组成或包含其的多肽；

b)由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列组成或包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

c)具有与a)或b)的氨基酸序列有70%或更高相同性的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性；

d)具有相对于SEQ ID NO:2所示氨基酸序列含有1-45个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的多肽，所述多肽具有硫代硫酸硫转移酶活性。

4.根据权利要求1-3之一的方法，特征在于通过选自下组的一或多种措施增加编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的表达：

a)所述基因的表达在启动子的控制下，所述启动子在用于所述方法的微生物中导致与起始菌株相比增加的表达；

b)与起始菌株相比增加编码具有硫代硫酸硫转移酶活性的多肽的基因的拷贝数；优选地通过将所述基因以多个拷贝插入质粒中或者通过将所述基因以多个拷贝整合进微生物染色体中而进行；

c)通过使用核糖体结合位点实现所述基因的表达，所述核糖体结合位点导致与起始菌株相比在用于所述方法的微生物中的翻译增加；

d)通过针对用于所述方法的微生物优化密码子使用而增加所述基因的表达；

e)通过降低由所述基因转录的mRNA中的mRNA二级结构而增加所述基因的表达；

f)通过消除由所述基因转录的mRNA中的RNA聚合酶终止子而增加所述基因的表达；

g)通过使用由所述基因转录的mRNA中的mRNA稳定化序列而实现所述基因的表达。

5.根据权利要求1-4之一的方法，特征在于二硫代硫酸盐是选自碱金属盐、碱土金属盐、铵盐(及混合物)的盐，优选铵盐。

6.根据权利要求1-4之一的方法，特征在于硫酸盐是选自碱金属盐、碱土金属盐、铵盐(及混合物)的盐，优选铵盐。

7.根据权利要求1-6之一的方法，特征在于在发酵期间将二硫代硫酸盐的含量基于在培养基中和发酵液中无机硫的总含量保持在至少5mol%。

8.根据权利要求1-7之一的方法，特征在于所述含硫氨基酸是L-甲硫氨酸。

9.根据权利要求1-8之一的方法，特征在于所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)，优选大肠杆菌(Escherichia coli)。

10.根据权利要求1-8之一的方法，特征在于所述微生物是棒杆菌属(Corynebacterium)，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。