[发明专利]离子交换色谱法用填充剂以及核酸链的分离检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于核酸链的分离检测的离子交换色谱法用填充剂。另外，本发明涉及使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。

背景技术

核酸为含有碱基、糖、磷酸的核苷酸通过磷酸酯键连接而成的生物体高分子，依据糖结构的不同被分类为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

近年来，开发了分析已经明确与各种疾病、药的副作用相关的单核苷酸多态性(SNP；Single Nucleotide Polymorphism)的技术，简便并且在短时间内精度良好地检测成为重要的要素。

作为SNP解析的主要方法，已知SSCP法(单链构象多态性)(例如，非专利文献1)。SSCP法为利用由单链DNA中碱基序列的差异所产生的高次结构的差异来检测SNP的方法。但是，SSCP法中利用放射性同位素或者荧光物质的标识是必要的，因此工程变得复杂，试药变得高价。另外，使用电泳来分离检测多态，因此存在操作繁杂、解析中需要时间等课题。

另外，作为SNP解析的其他方法，已知RFLP法(限制性片段长度多态性)。RFLP法为当存在识别PCR扩增产物中的基因变异部位的限制性酶时，在常规序列部位上设定引物，在其内侧即在PCR扩增产物内保持多态性而进行扩增，用限制性酶将得到的PCR产物切断，依据该片段的长度来判断有无多态的方法。但是，由于使用限制性酶，存在分析成本上升、解析总体的时间变长等课题。另外，由于通过电泳检测链长差异，所以存在操作变得繁杂、解析总体的时间变长等课题。

另一方面，在生化学、医学等领域中，核酸、蛋白质、多糖类这样的生物体高分子的分离中，作为能够简便且短时间内进行精度良好检测的方法，离子交换色谱法被广泛使用。

离子交换色谱法为利用在填充剂的离子交换基团与测定对象物质中的离子之间活动的静电相互作用来分离测定对象物质的方法，有利用阴离子交换的离子交换色谱法和利用阳离子交换的离子交换色谱法。阴离子交换液相色谱法采用具有阳离子性的官能团的柱填充剂，能够分离阴离子性的物质。另外，阳离子交换液相色谱法采用具有阴离子性的官能团的柱填充剂，能够分离阳离子性的物质。

采用离子交换色谱法对核酸的PCR扩增产物进行分离时，利用核酸分子中含有的磷酸的负电荷，使用阴离子交换液相色谱法。作为阴离子交换液相色谱法中的柱填充剂的阳离子性官能团，有二乙基氨基乙基这样的弱阳离子性基团、季铵基团这样的强阳离子性基团，具有这些阳离子性官能团的柱填充剂已经被市售，被用于各种研究领域中。

但是，就使用以往的柱填充剂的离子色谱法而言，无法充分地检测核酸链中的碱基序列差异、单碱基替换的差异。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Orita，M.，et al.：Detection ofpolymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：2766-2770，1989.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于，提供能够充分检测核酸链中的碱基序列差异或者单碱基替换的差异的离子交换色谱法用填充剂。另外，本发明的目的在于，提供使用该离子交换色谱法用填充剂的核酸链的分离检测方法。

用于解决课题的手段

本发明涉及，在基材微粒的表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团的离子交换色谱法用填充剂。

以下详细说明本发明。

本发明者等发现，通过采用在基材微粒的表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团作为离子交换基团的填充剂作为用于离子交换色谱法的填充剂，从而能够充分检测核酸链中的碱基序列的差异、单碱基替换的差异，至此完成了本发明。

本说明书中，所述上述强阳离子性基团表示在pH为1到14的宽范围下发生解离的阳离子性基团。也就是说，强阳离子性基团可以保持不受水溶液pH影响而解离的状态(阳离子化)。

作为上述强阳离子性基团，可以举出季铵基。具体地可以举出例如三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。

另外，作为上述强阳离子性基团的相反离子，可以举出例如氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。