[发明专利]心肌肌钙蛋白的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及样本中的心肌肌钙蛋白的高精度的测定方法和试剂盒。

背景技术

已知肌钙蛋白是包含3种蛋白：肌钙蛋白I、肌钙蛋白T和肌钙蛋白C的肌原纤维蛋白复合体，通过肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用，有助于对钙离子所致的肌肉收缩进行调节。具体地，冲动达到肌肉的运动终板的标准，从而产生动作电位，传导至肌质网。于是，钙离子被释放至细胞溶胶，并与肌钙蛋白C结合。这使得肌钙蛋白I和肌钙蛋白C的相互作用强化，由此引起肌钙蛋白I、T、C复合体的构型变化，使得可通过肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用进行肌肉收缩运动。

心肌受到不可逆损伤时，释放的心肌肌钙蛋白会出现在血流中。在血液中，心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白C和心肌肌钙蛋白T这3种亚基形成由其单独，或者由2种或3种不同的亚基构成的复合体（心肌肌钙蛋白）而存在。

为了评价各种心肌肌钙蛋白，通常使用血液试样（血清、血浆或全血）。但是，该选择可根据使用的方法而有所限制。这是由于已知例如，血清是不适于用于快速评价心肌肌钙蛋白的方法的生物学试样，或者全血难以实施定量试验的缘故。在使用加肝素血浆或加肝素全血来实施的免疫学测定中，即便是所用方法的性能非常高的情形，也时常得到缺乏可靠性的结果。通常，在血浆中的心肌肌钙蛋白浓度不太高时，会遭遇该问题（非专利文献1）。实际上，已知血液试样中肝素的存在会在各种免疫学测定的过程中造成干扰，从而给测定结果带来影响，由此可对医生的临床诊断造成掩饰。

作为抗凝剂，也常使用EDTA采血管，但对于加EDTA血浆或加EDTA全血，也能造成可靠性不高的结果。通常，血浆中的心肌肌钙蛋白I在钙离子的存在下，与心肌肌钙蛋白C、心肌肌钙蛋白T形成复合体。但是，在EDTA的存在下，由于钙离子被螯合，因而含有心肌肌钙蛋白I的复合体被分解。因此，已知加EDTA血浆或加EDTA全血中，心肌肌钙蛋白I的血中存在形式的改变会对免疫学测定造成影响（非专利文献2）。

迄今为止，关于心肌肌钙蛋白试验中避免样本中干扰物质的影响的方法，公开有一种免疫学测定方法，其特征在于，在溴化己二甲铵（聚凝胺）的存在下，对含有肝素的生物学试样实施该方法（专利文献1）。所以是避免来源于肝素的干扰的方法，对于EDTA并未提及。

此外，还公开了对心肌肌钙蛋白添加2价阳离子，由此对心肌肌钙蛋白复合体的稳定化有效（专利文献2、专利文献3、专利文献4）。

例如，专利文献2中，作为肌钙蛋白复合体的稳定组合物的缓冲液，列举了含有100μmol/L～100mmol/L的氯化钙或氯化镁浓度的组合物，作为优选的组合物，公开了含有2mmol/L氯化钙的实施方式（［0013］段）。但是，专利文献2中，关于肌钙蛋白试验时反应液中（即，免疫复合体形成时）的氯化钙或氯化镁，并未记载浓度，因此，对于必需在心肌肌钙蛋白的免疫学测定的反应液中维持高浓度，以及在低浓度（例如，2mmol/L）下根据样本的种类有时得不到正确值的情况既无暗示也无记载。

专利文献3记载了作为经稳定化的肌钙蛋白I的优选组合物，氯化钙或氯化镁的浓度为0.01mmol/L～10mmol/L。此外，实施例14中还公开了，在进行抗原抗体反应前向血清或血浆添加氯化钙以使最终浓度为6mmol/L，将所得溶液在室温孵育2小时后，在4℃孵育一夜，接着，将孵育后的样品用无金属试验缓冲液以稀释倍数2至最大稀释倍数256进行稀释的步骤。即，使得反应液中存在约3mmol/L以下的氯化钙。但是，对于必需在心肌肌钙蛋白的免疫学测定的反应液中维持高浓度，以及在低浓度（例如，约3mmol/L）下根据样本的种类有时得不到正确值的情况既无暗示也无记载。应予说明，专利文献3的实施例中使用的肌钙蛋白试验缓冲液中的氯化钙浓度为2mmol/L（例如，实施例10～12）。

专利文献4公开了，作为制备肌钙蛋白复合体时的缓冲液，钙离子和镁离子的浓度并不重要，但优选应为约20μmol/L～约20mmol/L，钙和/或镁的代表量为约2～5mmol/L。此外，虽然并不明确，但实施例1和实施例2中记载了在复合体制备用反应液中还含有其它钙盐，以提供每1升为约225毫克的氯化钙或1～3mmol/L钙离子。但是，专利文献4中，关于肌钙蛋白试验时反应液中的氯化钙或氯化镁，并未记载浓度，对于必需在心肌肌钙蛋白的免疫学测定的反应液中维持高浓度，以及在低浓度（例如，3mmol/L）下根据样本的种类有时得不到正确值的情况既无暗示也无记载。