[发明专利]三官能交联试剂

说明书

发明领域

本发明涉及三官能交联试剂、其产生方法以及其在用于检测、鉴定和表征配体与活细胞上以及生物流体(biological fluid)中的其相应糖蛋白靶受体之间的相互作用的方法中的用途，所述三官能交联试剂携带(i)用于与在靶糖蛋白受体上具有至少一个结合位点的目标配体缀合的配体反应性基团，(ii)用于捕获氧化的受体-糖肽的任选地被保护的芳香族肼基团和(iii)用于检测、分离和纯化所捕获的糖肽的亲和性基团。

发明背景

糖基化是最突出的蛋白修饰之一并且许多(如果不是大部分的话)由哺乳动物细胞产生的分泌性和膜结合的蛋白质包含共价连接的聚糖(Varki,A.等人Essentials of Glycobiology,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2009)。在复杂生物体的装配中，此类寡糖部分对于分泌的和细胞表面蛋白的折叠、亚细胞定位、周转(turnover)、活性和相互作用起着多种结构和功能作用。

分泌的糖蛋白包括例如细胞因子、激素、生长和分化因子、酶、神经肽、vasomediator、抗原识别分子、免疫调节分子、结构糖蛋白及其它生物活性分子。那些蛋白质在许多识别事件例如细胞与细胞信号转导、免疫应答、细胞凋亡、宿主-病原体相互作用以及许多疾病的发病机制中是重要的。由此，此类糖蛋白对于某些靶受体的特异性在调节细胞与细胞的通讯中是关键性的。因此，对分泌的糖蛋白与其靶标的配体结合相互作用的鉴定和表征对于生物信息传递的分子理解是关键的。

类似地，配体例如蛋白质、肽、激素、化学分子、药物或毒素与细胞表面糖蛋白受体(CSR)的接合使得信息能够从细胞微环境传递至细胞内。尽管事实上该细胞表面信息门户(information gateway)对于细胞应答是至关重要的，许多功能性配体的受体仍是未知的。这主要是由于疏水性膜受体蛋白质的鉴定方面的技术限制以及由于配体与其相应的CSR的瞬时低亲和力相互作用。因此，许多信号转导蛋白(signaling protein)和分子仍然是不具有已知主要分子靶标的孤儿(orphan)配体-对于关于信号转导、药物作用、脱靶效应或疾病相关信号转导网络的相应机制的详细分子理解，目前缺少宝贵的信息。

鉴定生物系统中瞬时的配体-受体相互作用的有前景的方法是对相互作用分子进行化学交联，随后对相互作用的伴侣进行质谱鉴定。目前已知的和商购可得的交联剂通常是为了其在定位溶液中分离的蛋白质的蛋白质界面中的应用而设计的。例如，同双官能或异双官能交联剂(包括可切割或同位素编码的衍生物)已被用于化学交联蛋白质，随后进行对经交联的肽的酶促降解和质谱鉴定，用于对蛋白质和蛋白质复合物的三维结构进行作图(JMS(2003)第38卷(12)pp.1225-37)。然而，利用此类分子获得的交联的肽种类通常具有非常低的相对丰度，并且对通过交联的肽产生的质谱的生物信息学分析仍然是艰巨的任务。这阻碍了复杂生物样品中交联位点的鉴定，特别是对于配体与其相应受体的通常瞬时的相互作用的检测而言。

为了将交联的肽从复杂样品中富集出来，已公开了三官能交联剂，所述交联剂具有两个用于捕获相互作用蛋白质的反应位点(通常为氨基反应性、巯基反应性或光反应性)和用于随后富集所捕获的肽的亲和性基团(通常为生物素)的组合(J Am Soc Mass Spectrom(2005)第16卷(12)pp.1921-31)。虽然已将此类交联剂成功地用于对分离的蛋白质和蛋白质复合物的拓扑结构作图，但它们的化学性质使得它们不适合用于检测源自活细胞的复杂样品中的瞬时蛋白-蛋白相互作用。

这凸显了对适当试剂的需要，所述试剂能够特别地辅助探测、鉴定和表征配体与其生物微环境中（例如生物流体中或与活细胞的质膜结合）的靶糖蛋白受体的相互作用。就本申请者所知，当今已知的两种交联剂中的任一种都不能满足使得能够共价稳定化并随后质谱鉴定已知配体与复合物及天然环境(例如活细胞的表面)中的未知糖蛋白受体结合伴侣之间的特异性相互作用的结构要求。