[发明专利]用于细胞培养基工程化的功能环境学方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于最优化细胞培养基的组成的方法。描述了用于测定介质因子的最佳值的方法，从而按照用户需要增强或抑制靶标基本细胞功能。所述方法包括通过执行细胞培养实验和优选外代谢物组（exometabolome）的高通量分析法构建功能环境学图谱，随后基于介质因子的所述功能进行介质因子值调整。

发明背景

细胞生长制剂在水溶液中包含数百种单独的成分。它们通常由下述组成：营养物例如蛋白胨、氨基酸、肉类提取物和酵母提取物；矿物质和维生素、抑制剂和固化剂。这些成分中的某些对于细胞生长或生产率可能是至关重要的，其它成分在某种水平上可能是有毒性的，并且许多成分可在细胞内的相同或竞争性途径中参与复杂的相互作用。包含哺乳动物细胞生长所必需的生长因子的血清（胎小牛血清FCS和胎牛血清FBS)已被广泛用作用于动物细胞培养的培养基补充物。然而血清的使用正被渐渐停止，因为监管机构对使用动物来源的材料生产活性药物成分(API)施以了非常严格的限制。若干文献(例如WO2008009642、WO2009149719、US2009061516)公开了能够支持动物细胞的体外培养的无血清细胞培养基制剂。

通过统计学实验设计（design-of-experiments）(DoE)支持的密集实验（Intensive experimentation）是用于确定细胞培养基的最佳组成的现有标准方法。然而该方法耗时且昂贵。单个地或在平行实验中以小的组合的方式筛选培养基成分，这显著限制了发现许多培养基成分之间的复杂相互作用的能力。已报导了众多关于使用DoE对通过反应器或摇瓶实验支持的细菌、真菌、哺乳动物细胞和干细胞培养进行培养基最优化的研究([2]、[5]、[6]、[8])。最常见的DoE法是利用两个浓度水平的所谓的缩减因子设计（reduced factorial design），其允许在有限次数的实验中初步筛选5至10种介质因子([7]、[2])。例如，文献号US2008248515公开了使用2-水平因子设计和最速上升法（deepest ascent method）确定无血清真核细胞培养基补充物的最佳组成的方法。通过使用DoE，同时比较数种介质因子，测量它们的作用，并基于反应变量的测量对其进行排序。反应变量通常是代谢物的浓度、细胞和产物浓度。一旦确定了反应变量，就可使用统计性能参数例如方差分析(ANOVA)来评估所测量的作用的相关性。相关于它们的影响力对介质因子进行排序，随后选择最有效的因子，并在另外的实验中进一步进行测试[2]。最后，建立回归模型来确定介质因子的最佳水平[2]。

统计学DoE法的主要劣势是，由于其经验主义的性质，当用于许多具有潜在相互作用的介质因子时，其成本膨胀。为了加速对大量介质因子的筛选，最近基于微生物生物反应器技术开发了高成本的高通量培养基最优化设备，目标是使得能够并行筛选数千种营养物水平或其组合。减少工作量和加速培养基开发的另一个策略是将培养基成分分成浓缩的相容性制剂小组（如文献号NZ243160中公开的）。也提出了较少经验性因而更快速且更便宜的方法。文献号MX2009004974公开了用于细胞培养基设计的合理方法，其中基于培养的细胞的蛋白质含量、所表达的重组蛋白质的氨基酸组成和细胞维持需求来计算培养基中的氨基酸浓度。

如今存在可用于较少经验性和倾向（tendencially）机械性的培养基设计的更先进的系统生物学工具。Kell和同事显示出在外代谢物组(所有细胞外代谢物的浓度)与细胞内状态之间存在紧密联系[9]。他们显示出外代谢物组动力学提供了细胞代谢活性以及间接地基因组和蛋白组状态的信息性和准确的“足迹”。事实上，培养基不仅输送关键的营养物而且还输送参与基因表达调控的小分子和蛋白质(例如[3])。然而先前从未描述过使用外代谢物组来改善培养基的组成。

在文献号WO2004101808中，描述了用于使用基因组学和/或蛋白质组学来开发细胞培养基制剂的方法。其描述了用于配制细胞培养基的方法，包括检测细胞中的序列，所述序列是核酸序列（例如关于基因组的信息）或所表达的氨基酸序列（例如关于蛋白质组的信息），以及配制包含调节所检测的序列或其表达或调节受所检测的序列或其表达影响的细胞过程的分子的细胞培养基，其中不比较所述分子对不同细胞系或不同培养条件的影响。然而，这样的方法提出了3个主要的问题：i)寻找单个分子相互作用已被证明昂贵且困难，ii)在基因表达、蛋白质组与细胞表型之间存在公知的空缺，iii)基因表达或蛋白质组数据的系统性收集是困难且昂贵的。因此使用基因组学和/或蛋白质组学来进行系统性培养基设计在许多情况下可能是不可行的。