[发明专利]核酸的检测方法以及用于该方法的装置、试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的检测方法以及用于该方法的装置、试剂盒。

背景技术

在进行使用组织、血液、唾液、尿等的生物体试样的基因临床检查、食品或植物等的基因分析时，为了高效地分析靶标核酸，利用PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链反应)法、LAMP(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)法等核酸扩增法。这些方法在为了检测出微量的标的时有效。但是，扩增反应后的含有核酸的溶液需要进行回收转移至其他的检测操作，此时，需要使反应容器开放，因此，有可能含有核酸的样品飞散到外部或其他反应液混入而出现假阳性的结果。另外，在扩增核酸的检测中需要特殊的装置、熟练的检查技术。因此，实际情况是临床检查或床边等试样在采取现场的检查尚未普及，检查限定于在受托中心或专门的研究机关实施。

作为扩增核酸的检测方法，最一般使用的是将扩增反应后的溶液用琼脂糖电泳分离后，用荧光性嵌入剂染色，观察特异性的荧光的方法(非专利文献1)。但是，为了用荧光检测检测，需要引物、嵌入剂等的昂贵的化合物以及UV照射装置等激发装置、凝胶照相装置等的昂贵的机器。另外，扩增核酸的电泳需要长时间的泳动步骤。

作为核酸扩增方法，LAMP法具有在反应中不需要温度循环、在等温进行，与PCR法比较扩增量多的优点。特别是作为不依赖于荧光检测LAMP法的扩增核酸的方法，已知有利用作为反应的副产物的焦磷酸产生不溶性的镁盐的白浊的检测、以及利用荧光金属指示剂的反应液中的镁浓度变化的检测(专利文献1、非专利文献2)。然而，在这些检测方法中，实际情况是由于不能可靠地目测确认扩增的有无，所以需要浊度计或UV照射装置等机械。

为了解决以上的问题，目前为止进行了多种尝试。报道了例如能够在单一容器中进行核酸的扩增和检测的装置(专利文献2)。但是，使用昂贵的标记引物，需要另外添加检测试剂等，比较繁琐。或者，也报道了通过在容器中添加预先干燥的核酸扩增试剂，使操作简便化，且能够在封闭体系中进行核酸扩增的装置(专利文献3)。但是，在检测时需要使反应容器开放，不能在检测出以前始终地在封闭体系中进行。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特许第4683811号

专利文献2:日本特开2003-38161号公报

专利文献3:日本特开2009-201458号公报

非专利文献

非专利文献1:Molecular Cloning second edition，vol.1，6.15(1989)

非专利文献2:Nature Protocols，vol.3，No.5，p877-882(2008)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供：能够用可见光将由核酸扩增法扩增得到的核酸在反应结束后立即在容器内检测的核酸检测方法、以及、从核酸的扩增至检测能够不使容器的封闭体系开放而进行的检测用装置。

解决问题的方法

本发明的发明人经过深入研究结果发现：通过将用于由可见光检测核酸的试剂预先装入作为封闭体系的反应容器或其盖中，可以溶入核酸扩增后的溶液中而不用开放反应容器，因此能够防止样品的飞散和污染，能够简便且以短时间由可见光检测出核酸的扩增，从而完成了本发明。

即，本发明涉及核酸的检测方法，其包括使核酸与检测试剂在封闭体系内接触的步骤、以及由可见光判定核酸和／或检测试剂的显色的步骤。

此外，优选在上述接触步骤之前或之后，包括扩增核酸的步骤。

优选检测试剂为固体。

优选检测试剂包含隐色型染料。

优选隐色型染料为三芳基甲烷类染料。

优选三芳基甲烷类染料为结晶紫或龙胆紫。

优选检测试剂含有亲核剂和／或稳定剂。

优选亲核剂为选自硼氢化钠、氰化硼氢化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、2-巯基乙醇、DL-二硫苏糖醇、1-硫甘油(1-thioglycerol)、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇、以及三2-羧基乙基膦中的1种以上的亲核剂。

优选稳定剂为选自α环糊精、β环糊精、γ环糊精以及抗坏血酸中的1种以上的稳定剂。

核酸的扩增优选利用LAMP法进行。优选在LAMP法中使用焦磷酸除去酶。优选焦磷酸除去酶为耐热性的焦磷酸酶。