[发明专利]用于修饰核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于修饰核酸的方法，所述方法可有效地减少当进行核酸检测方法时由样品中含有的核酸衍生出的信号；用于所述方法中的试剂盒；和用于它们的组合物。

背景技术

目前，核酸检测技术是医学和生物学领域中的常用研究工具，且已经被广泛地用于定性和定量测量中。尤其是与以PCR方法为代表的核酸扩增方法相组合的这样的核酸检测技术，能够检测到非常少的细胞或微生物的存在，这通过靶向这些细胞或微生物特有的核酸来实现。因此，核酸检测技术已经被广泛地用作高灵敏度分析方法用于基础研究以及用于工业中。核酸检测技术还被用于分销渠道追踪和鉴定，其中将特定序列的核酸人工地掺入材料或物品中以标记它。

另一方面，利用核酸扩增方法的检测方法具有干扰其它样品的分析的问题，该问题是由在检测工作期间核酸扩增反应所产生的扩增核酸造成。由于核酸扩增反应会通过对数核酸扩增产生巨大数目的扩增产物分子，无意中存在于其它样品、试剂、试验装置或试验环境中的扩增产物可以作为模板被扩增，并由此可能得到错误的分析结果。

为了防止对扩增产物的这种人工扩增的目的，除了对样品、试剂、试验装置等的严谨操作和试验环境的清洁的一般性注意以外，还已经开发了用于防止扩增核酸干扰其它试验的手段。例如，已知生产对尿嘧啶-N-糖基化酶敏感的扩增核酸的方法，该方法包括：在含有脱氧尿嘧啶三磷酸的反应溶液中扩增核酸。通过在扩增反应之前用尿嘧啶-N-糖基化酶处理样品或反应溶液，可以降解从其它试验衍生出的扩增核酸。另外，还报道了防止核酸在核酸扩增反应中充当模板的方法，该方法包括：用光活化的补骨脂素化合物通过共价键来修饰核酸(非专利文献1)。

用于修饰核酸以防止它在核酸扩增反应中充当模板的技术还已经用于微生物的检测中。据称，源自死细胞的DNA会在样品中保留至细胞死亡后几天至3周。当DNA是通过平常程序从样品中提取时，它们包括源自活细胞和死细胞两者的DNA。因而，例如，当对样品进行灭菌处理时，如果使用核酸作为指标，微生物检测方法不会完全反映灭菌的结果。

作为上述问题的解决方案，已经报道了区分活细胞和死细胞的方法，所述方法包括核酸修饰剂与核酸扩增方法的组合(非专利文献2, 专利文献1)。该基于核酸的检测方法是通过使用扩增的存在或速率作为指标来将活细胞与死细胞区分开的方法，所述方法包括：与诸如实时PCR等核酸扩增方法联合使用核酸修饰剂诸如单叠氮乙锭(ethidium monoazide，EMA)或单叠氮丙锭(propidium monoazide，PMA)。例如，据报道，EMA会在可见光下活化以与核酸共价地键合，使得核酸扩增反应受到抑制。与此同时，在样品中保持处于游离状态的未结合的EMA通过与水分子的反应而被失活。源自活细胞（由于完整细胞壁和细胞膜，EMA没有侵入）的核酸不会经历EMA的作用。另一方面，源自死细胞（其已经被EMA侵入）的核酸被EMA修饰，使得以后的核酸扩增反应受到抑制。因而，当用上述核酸修饰剂处理由活细胞和死细胞的混合物组成的样品时，源自活细胞的核酸被选择性地扩增。迄今为止，这样的方法已经应用于许多微生物，以检测与死细胞区分开的活细胞，所述微生物例如大肠杆菌（Escherichia coli）O157、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、李斯特氏菌属（Listeria）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）和军团菌属（Legionella）。但是，已经报道，高浓度的核酸修饰剂会造成对活细胞的损伤，尽管它会确保与源自死细胞的核酸的结合。

因而，核酸的修饰具有多种应用。因此，需要更有效地修饰核酸的方法。

引文列表

专利文献

专利文献1: JP-B 4127847

非专利文献。

非专利文献1: Nucleic Acids Research, 第19卷, 第99-107页, 1991

非专利文献2: Appl. Environ. Microbiol., 第73卷, 第8028-8030页, 2007

发明内容。

技术问题

本发明的一个目的是，提供有效地修饰核酸的方法，所述核酸需要防止被检测出，从而改进各种基于核酸的检测技术的准确度。

问题的解决方案