[发明专利]对转基因边界的高通量分析

说明书

发明领域

一般而言，本发明涉及植物分子生物学和生物化学领域。本发明关注用于分析转基因边界及测定在转基因侧翼的染色体序列的改良的聚合酶链式反应(PCR)方法。

发明背景

测定与插入转基因相邻的染色体侧翼序列和基因组位置在技术上是挑战性的。已经开发出多种方法来克服鉴定在已知DNA序列侧翼的未知DNA序列的限制。然而，这些用于鉴定在已知转基因侧翼的基因组染色体序列的传统PCR方法诸如LM-PCR(又称为基因组步移(Genome Walking))和其它方法(包括：反向PCR(i-PCR)、热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、锚式PCR(a-PCR)和随机引发(randomly primed)PCR(rm-PCR))由于制备过程中的DNA损失而受到低检测灵敏性(需要大量模板DNA)或低特异性阻碍。

聚合酶链式反应(PCR)是一种通常采用的分子生物学方法。该方法如下实施：使双链模板DNA变性，将寡核苷酸引物与DNA模板退火，并经由DNA聚合酶延伸DNA链。寡核苷酸引物设计为与DNA的相反链退火，并且定位为使得由DNA聚合酶生成的DNA链充当另一引物的模板链。重复每个循环，导致DNA片段的指数扩增。(Mullis等,美国专利No.4,683,195,4,683,202,及4,800,159)。本领域技术人员使用PCR对于扩增和分离DNA片段以进行后续分析是基本的。

经由聚合酶链式反应(PCR)分离和分析DNA模板要求侧翼DNA序列的知识。不幸的是，此要求限制对已知DNA序列区域的PCR扩增。使用PCR方法鉴定转基因位置在基因组内的位置受到转基因对生物体基因组内未知染色体位置的随机插入阻碍。鉴定与已知DNA序列相邻定位的未知DNA序列的方法对于鉴定生物体染色体内的转基因位置是必要的。另外，可以使用此类方法鉴定新颖的基因序列，从而鉴定新性状，测定已经插入生物体的基因组中的转座子或病毒序列的基因组位置，或者鉴定经由插入诱变插入基因组中的多核苷酸序列的染色体位置。

已经开发出多种方法来克服在已知DNA序列侧翼的未知DNA序列的限制。连接介导的PCR(LM PCR)方法(其中生成基因组文库，并将衔接头与DNA片段退火以进行PCR扩增)以GENOME WALKER UNIVERSAL KITTM(参见美国专利No.5,565,340,及美国专利No.5,759,822)销售。常用的另一种方法是反向PCR反应(参见Silver and Keerikatte(1989),J.Virol.,63:1924-1928)，其中将DNA用限制酶消化，并自身连接，生成连续环。使用结合已知序列的寡核苷酸引物的PCR扩增导致未知侧翼序列的扩增和阐明。不幸的是，这些方法是效率低的且费时的。这些和其它传统PCR法(包括热不对称交错PCR[TAIL-PCR]、锚式PCR[a-PCR]和随机引发PCR[rm-PCR])由于制备过程中的DNA损失而受到低检测灵敏性(需要大量模板DNA)或低特异性阻碍。

可以通过纯化含有已知的和未知的DNA序列两者的染色体DNA片段来改善检测灵敏性的方法的开发可以产生用于检测和表征与已知DNA序列相邻定位的未知DNA区的灵敏方法。线性扩增介导的聚合酶链式反应(LAMPCR)方法的开发实现这些目的。参见美国专利No6,514,706。LAM PCR法特别适合于扩增和分析其序列仅部分已知的DNA片段。

可以通过纯化含有已知的和未知的DNA序列两者的染色体DNA片段来改善检测灵敏性的方法的开发可以产生用于检测和表征与已知DNA序列相邻定位的未知DNA区的灵敏方法。LAM PCR法的开发实现这些目的。LAMPCR是一种用于分析与已知DNA序列相邻定位的未知染色体侧翼序列的改良PCR方法。可以使用LAM PCR法来将在已知DNA或RNA区侧翼的未知DNA或RNA序列鉴定和/或测序。