[发明专利]抗线虫方法和组合物

说明书

发明领域

本发明涉及使用线虫融合家族蛋白的在细胞-细胞融合中有用的方法和组合物。还提供了利用线虫融合家族的促融合蛋白（fusogenic protein）的抗线虫方法和组合物。 

发明背景 

从小的细胞内的囊泡和细胞器至整个细胞的范围，几乎所有的膜都能够融合。因此，膜融合对许多生物过程诸如受精、胚胎及胚后发育、细胞内转运和病毒感染至关重要（1-6）。外质膜细胞融合过程包括质膜的合并。该过程可以是瞬时的，如在精卵融合的情况下，导致继续分裂的二倍体细胞，或永久性的，导致合胞体多核细胞的形成。此合胞体作为后生动物中一些体细胞组织的必要组成部分，包括肌肉形成中的肌管、骨形成中的破骨细胞和哺乳动物胎盘形成中的合胞体滋养细胞。外质膜细胞融合还在特定的病毒感染过程中发生，由于包膜病毒（诸如，例如，流行性感冒、HIV和狂犬病毒）将它们的膜与宿主的质膜或内体膜融合。与外质膜细胞-细胞融合相似，病毒-细胞融合在融合膜的外层之间发生且，这样与在细胞内发生的内质融合事件在许多方面不同（例如，液泡膜在细胞器之间的转运）。 

膜融合的分子机制的现有模型依赖于主要针对病毒的和细胞内的融合介导蛋白（被称为促融合剂（fusogen））执行的实验和生物物理分析。然而，这些模型如何对应细胞-细胞促融合剂的作用机制是未知的（4,5）。例如，美国专利号US7,402,409涉及细胞融合方法。另外的细胞融合方法，例如被Gottesman等人（18）描述。 

来自线虫秀丽隐杆线虫（C.elegans）的AFF-1（Anchor-cell Fusion Failure-1）和EFF-1（Epithelial Fusion Failure-1）蛋白是首个被鉴定并因此 是线虫中保守的促融合剂（即，通过细胞的脂质双分子层的融合介导细胞与细胞的融合的蛋白）家族的创始成员（4）。秀丽隐杆线虫FF蛋白（CeFF's）被显示诱导异源昆虫细胞中的融合（例如，参考文献7-11）。aff-1和eff-1突变体是可存活的，但具有严重的身体畸形和与细胞融合失败相关的生殖缺陷（9,10）。EFF-1作为促融合剂的功能需要其在两个融合配偶体中的表达（8）。融合家族（EF）家族的蛋白在线虫中是非常保守的。在不同的线虫种类中鉴定出FF成员，表明FF家族在线虫动物门是保守的（4）。只有少数的EF家族成员在线虫外被鉴定出，它们中没有一个在植物或在脊索动物中。 

线虫是最多样化的假体腔动物门，并是所有动物中的最多样化之一。已描述了超过28,000种线虫种类（12）且约16,000种线虫是寄生的。线虫已适应于几乎每一个已知的生态系统。 

一般来说通过线虫的感染且特别是寄生线虫可影响不同的宿主，诸如，例如，牲畜、人、海洋生境、植物等等（13），导致健康相关的和经济的后果。因此，感染的有效防治将对农业、耕作和医学与由此产生的经济影响作出显著贡献。例如，世界卫生组织（World Health Organization）估计至少20亿人被寄生线虫感染，而估计植物寄生线虫的损害在美国每年造成的损失为～40-100亿美元并在全世界每年造成的损失超过$800亿。目前在使用中的抗线虫剂（还被称为抗蠕虫药（antihelminthic）、打虫药（anhelmintic）和杀蠕虫药（vermicide）），主要包括被设计以杀死寄生虫或将其从其宿主中排出的化学品、药物或天然产生的化合物。然而，这些抗线虫剂的大部分是剧毒的且如果以不当的剂量使用对人是危险的。此外，化学品的持续使用导致抗性蠕虫的积累且不可避免地导致治疗的失败。另外，防治病原体诸如寄生线虫可能是极其昂贵的。 

因此，对特异的、安全的、无毒的、经济的并对环境具有最小的影响的新的抗蠕虫方法和组合物有未满足的需求。使用线虫促融合剂作为外生表达的、用于病毒颗粒与细胞的融合或植物和动物界的高等生物的细胞之间的细胞-细胞融合的介质在本领域中未被教导或提出。 

发明概述 

本发明提供了使用包括线虫起源的促融合剂的至少胞外部分的促融合蛋白，用于包括但不限于哺乳动物细胞、植物细胞、鸟类细胞和类似的细胞的融合，和细胞与病毒颗粒的融合的方法和组合物。本发明还公开了抗线虫方法和组合物、用于它们的制备的方法、和其用途。