[发明专利]用于增强细菌中功能蛋白表达的方法和材料

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年2月3日提交的美国临时申请号61/439,232的优先权，该临时申请以引用方式整体并入。

电子提交材料的以引用方式并入

以引用方式整体并入了与此同时提交并标识如下的计算机可读氨基酸序列表：一个创建于2012年2月3日的名称为“45785A_seq_listing.txt”的8,192字节ASCII（文本）文件。

技术领域

本发明涉及可用于在原核细胞中表达异源蛋白的材料和方法。

背景技术

FkpA为表现分子伴侣和顺-反肽基脯氨酰异构酶活性的大肠杆菌(E.coli)的周质蛋白。天然FkpA通过指导向周质分泌的信号序列而作为大肠杆菌中的245个氨基酸的同二聚体局限于周质间隙。FkpA的伴侣活性存在于成熟蛋白的前120个氨基酸中，并且肽基脯氨酰异构酶活性存在于第121至245位氨基酸中。已研究了周质中的FkpA过表达对抗体单链可变片段(scFv)的周质产量的影响。参见Ramm和Pluckthun,J Biol Chem,275:22,17106-17113(2000)。

Skp为用于大肠杆菌中外膜蛋白组装的17-kDa周质伴侣，其有利于外膜蛋白中间体的正确折叠以及帮助维持它们的溶解性。Skp用作同三聚体并且属于含腔体伴侣的家族，这些伴侣将其底物结合到腔体中，从而为正确折叠提供合适的环境并且防止底物聚集。已研究了胞质中的Skp和细菌胞质中的Fab抗体片段的共表达的作用。参见Levy等,Protein Expr Purif.23(2):338-47(2001)。

在原核系统中表达异源蛋白诸如抗体的常见问题是，异源蛋白的聚集程度使得大部分蛋白质不溶解或失去功能。本发明的方法和材料提供该问题的解决方案。

发明内容

本公开涉及可用于提高原核细胞（例如，大肠杆菌细胞）中异源表达蛋白（例如，抗体）的产量的方法和材料。提供了在胞质中表达FkpA和/或Skp并分泌所关注的异源蛋白（例如，抗体）的原核宿主细胞。发明人意外地发现，缺乏信号序列使得FkpA和Skp局限于胞质而非周质的表达FkpA和Skp的大肠杆菌细胞可显著提高大肠杆菌周质中分泌的可溶性正确折叠的功能异源蛋白的产量。

本公开的一个方面提供用于重组制备的表达异源蛋白的原核宿主细胞，其包含(a)编码(i)不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA或(ii)不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸，以及(b)编码该异源蛋白的多核苷酸，其中该异源蛋白连接到功能信号序列。在一些实施方案中，宿主细胞包含(i)编码不连接到功能信号序列或其功能片段的FkpA的多核苷酸，以及(ii)编码不连接到功能信号序列或其功能片段的Skp的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸位于相同的载体中；而在其他实施方案中，它们位于不同的载体中。在一些实施方案中，两种多核苷酸在相同的信使RNA上表达。

本公开的相关方面提供这些可操作地连接到调节控制序列的多核苷酸，所述调节控制序列用于调节被编码蛋白质的表达。另一个相关方面提供包含这些多核苷酸的载体或染色体。本公开的另一个相关方面提供包含此类多核苷酸和/或载体和/或染色体的宿主细胞，以及使用此类宿主细胞重组表达此类异源蛋白（包括抗体和抗体片段）的方法。本公开的又一个相关方面提供由多核苷酸编码的异源蛋白，其展示在噬菌体粒子的表面上，或者以分离或纯化的形式。

在本文所述的一些或任何实施方案中，原核宿主细胞选自大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以及粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)。在示例性实施方案中，原核宿主细胞为大肠杆菌。