[发明专利]质粒DNA亚型和拓扑异构体的液相分离

说明书

发明领域

本发明涉及分离质粒DNA的亚型、拓扑异构体、低聚形式和高聚形式的色谱材料和方法，该质粒DNA通过使用氨基甲酰基修饰的阴离子交换配体固定在或嵌入到到非均质基质。

发明背景

质粒DNA(pDNA)是染色体外的遗传单位，其为宿主细胞提供附加的功能。自从发现其在基因治疗或遗传接种的重大潜力，这些新型药物的生物技术产物引起了非常大的重视(Schleef,M.,Plasmids for Therapy and Vaccination,Wiley-VCH,Weinheim2001)。在许多可能的亚型中，所谓的共价闭合环型(ccc)被认为对治疗是最有效的。药用级ccc质粒DNA是在大肠杆菌中发酵然后经过pDNA的获取、碱性裂解和多步纯化制得的(Urthaler,J.等,Journal of Biotechnology,2007,128,pgs:132-149)。对于人类基因治疗，所有这些步骤必须满足监管指南的要求。因此，应避免使用动物来源的化合物(例如酶，例如鸡卵清溶菌酶)和/或有毒试剂。此外，生产过程必须保证低水平的宿主相关杂质(例如细菌宿主的内毒素)，参阅Urthaler,J.,Chemical Engineering & Technology,2005,28,pgs:1408-1420。此外，有关其他pDNA亚型的ccc型在生物活性药物的最终制剂中建议具有高含量(FDA,U.,in:Administration,F.a.D.(Ed.),Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications,Rockville,MD2007)。

除了在质量控制中，在上游和下游加工过程中也需要对质粒亚型分布进行可靠分析。除了ccc型，治疗和接种效果较差的其他类型需要被监控：(a)由ccc型通过DNA主链的单个断口形成的开环型(oc)，和(b)当两个断口紧挨着时形成的直线型(lin)。除了这些单体型，在发酵过程中也可产生二聚形式和低聚形式(Lahijani,R.等,Human Gene Therapy,1996,7,pgs:1971-1980)，例如串联型(即，长的连续DNA分子，其包含串联连接的多重复制的相同DNA序列)和连环型(即，彼此交织成链的环状DNA)。连环DNA是环对环连接，而连锁DNA是端对端连接。