[发明专利]改变型脂肪酶及其制造方法、以及使用该酶的反应

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的改变型脂肪酶及其制造方法以及使用该酶的各种反应。更详细而言，涉及一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改变型脂肪酶。进而，涉及一种使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。

另外，本发明涉及一种使用已知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。

背景技术

目前，将脂肪酶用作催化剂得到氨基甲酸酯化合物的方法（氨基甲酸酯化）例如已知有在脂肪酶的存在下通过3’,5’-二氨基核苷（脂肪族胺化合物）和碳酸二乙酯化合物的反应来合成氨基甲酸酯的方法（非专利文献1）。

但是，脂肪酶相对于底物的添加量多、反应时间长且产物的收率也低，使用脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的制造方法难以说是满足产业化的制造方法。从这些方面考虑，寻求一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。

另一方面，进行了改变脂肪酶的氨基酸序列来提高活性、稳定性的研究（非专利文献2和3）。但是，尚未得知通过改变氨基酸序列提高了氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。

另外，专利文献1记载了通过改变脂肪酶（CALB）的氨基酸序列来增加丙烯酸酯活性，但记载了将104位的色氨酸单独取代为苯丙氨酸会造成活性的降低。

现有技术文献

专利文献

专利文献：WO2009/080676A1

非专利文献

非专利文献1：J.Org.Chem，2004年69卷p.1748-1751

非专利文献2：ChemBioChem2010年11卷p.789-795

非专利文献3：J.Amer.Chem.Soc.，2005年127卷p.13466-13467

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，提供一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改变型脂肪酶、以及使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。

另外，本发明的目的在于，提供一种使用公知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。

用于解决课题的方法

本发明的发明者们的目的在于，通过选择CALB作为脂肪酶，制作CALB的突变体来提高氨基甲酸酯化活性从而降低制造氨基甲酸酯化合物所需的成本。而且，进行了潜心研究，结果成功制成具有高于野生型的氨基甲酸酯化活性的突变CALB。另外，本发明的发明者们还发现，公知的改变型CALB具有较高的氨基甲酸酯化活性。即本发明提供下面的发明。

（1）一种改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将序列编号1的193位谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性。即，具有Q193X（在此，X表示谷氨酰胺以外的任意的氨基酸）的序列编号1的单独改变型脂肪酶或其突变体。

（2）根据（1）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有Q193E或Q193D的序列编号1的单独改变型脂肪酶或其突变体。

（3）根据（1）或（2）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F的序列编号1的双重改变型脂肪酶或其突变体。

（4）根据（1）或（2）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+[L278K或L278R]的序列编号1的双重改变型脂肪酶或其突变体。