[发明专利]不含衣壳的AAV载体、组合物以及制备载体和基因递送的方法

权利要求书

1.一种用于无需病毒衣壳介导的吸收过程而将外源DNA序列递送至靶的不含衣壳的AAV载体，所述载体是分离的线性核酸分子，其由按以下顺序的第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、感兴趣的核苷酸序列和第二AAV ITR组成，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列，所述分离的线性核酸分子不是质粒，且所述核酸分子没有被衣壳化。

2.权利要求1的载体，其中所述感兴趣的核苷酸序列为外源DNA的表达盒。

3.权利要求1的载体，其中所述核酸分子是单链的。

4.权利要求1的载体，其没有AAV rep蛋白编码序列。

5.权利要求1的载体，其中所述感兴趣的核苷酸序列包含4200-15000个核苷酸。

6.权利要求2的载体，其中所述外源DNA序列编码蛋白或者正义寡核苷酸或反义寡核苷酸。

7.权利要求2的载体，其中所述感兴趣的核苷酸序列包含指导所述外源DNA优先或完全地以组织或器官特异性方式表达的启动子。

8.权利要求2的载体，其中所述外源DNA编码U7 snRNA、RNAi或siRNA。

9.一种制备权利要求1-8中任一项的载体的方法，所述方法包括：

(a)提供包含核酸序列的细胞，所述核酸序列包含两个AAV ITR和位于所述ITR之间的感兴趣的核苷酸序列；其中所述核酸序列没有AAV衣壳蛋白编码基因，并且所述细胞不表达AAV衣壳蛋白；

(b)如果所述细胞中不存在AAV Rep基因或蛋白，则任选地向所述细胞提供AAV Rep基因或蛋白，但不提供AAV Cap基因或蛋白；

(c)使所述细胞在允许由ITR和表达盒组成的DNA复制和释放的条件下生长；

(d)收集所述由ITR和表达盒组成的DNA。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞系为Sf9。

11.一种介导哺乳动物细胞中外源DNA的表达的体外方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向所述细胞递送有效量的权利要求1-8中任一项的载体；

(b)使所述细胞在允许细胞表达所述外源DNA的条件下生长；

其中所述有效量足以允许细胞表达期望水平的所述外源DNA。

12.权利要求11的方法，其中所述递送包括简单地将所述载体引入胞外培养基中，并且不包括使用任何其他转导手段。

13.一种在细胞中引起期望的基因产物或寡核苷酸表达的体外方法，所述方法包括在不存在转染试剂或额外的物理手段的情况下使至少一种权利要求1-8中任一项或通过权利要求10的方法获得的载体与细胞表面接触以促进所述分离的线性核酸分子进入所述细胞。

14.权利要求1-8中任一项的载体用于将介导外源DNA表达的感兴趣的核苷酸序列递送入对象的细胞、器官或组织的用途。

15.权利要求1-8中任一项的载体用于介导对象的细胞、器官或组织中的外源DNA表达的用途。

16.权利要求15的用途，其中所述对象是哺乳动物。

17.权利要求1-8中任一项的载体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗有需要的对象中的疾病的方法，所述疾病涉及由于减少或终止的多肽表达或者表达所述多肽的无功能或功能较差的类似物而表现出症状的遗传缺陷，其中所述感兴趣的核苷酸序列包含跳跃、纠正、沉默或掩盖该缺陷的寡核苷酸或多核苷酸，导致与疾病或病症相关的症状的改善。