[发明专利]在同一多糖链的4位或6位生物技术硫酸化的硫酸软骨素及其制备方法

权利要求书

1.用于制备其中在同一多糖链中的所有N-乙酰基-D-半乳糖胺单元被随机地或者在4-位或6-位单硫酸化的硫酸软骨素钠盐的方法，所述方法包含下述步骤：

a.将软骨素钠盐转化成其游离酸或其与选自四甲基铵、四乙基铵或四丁基铵的季铵阳离子的盐或者转化成吡啶盐或甲酯；

b.在酸催化存在下，使步骤a)中得到的化合物与其中R选自氢、甲基、乙基或苯基并且R₁选自甲基或乙基的式RC(OR₁)₃的原酸酯反应，得到其中软骨素中存在的重复二糖单元具有式I结构的化合物，

其中R、R₁如上文所定义；

c.在吡啶或选自三乙胺或三异丙基乙胺的有机叔碱，以及4-二甲基氨基吡啶(DMAP)存在下，通过与其中R₂选自甲基、乙基或丙基的式(R₂CO)₂O的酸酐反应而保护前面步骤中获得的化合物的葡糖醛酸单元的2’和3’位羟基，得到其中软骨素中存在的重复二糖单元具有式II结构的化合物，

其中，R、R₁和R₂如上文所定义；

d.用水溶性有机酸使步骤c)中得到的产物中存在的原酸酯官能团重排，得到酯衍生物，在该酯衍生物中，多糖中的重复GalNAc单元由具有式IIIa或IIIb的三酰基衍生物构成；

其中，R和R₂如上文所定义；

e.将步骤d)中得到的化合物单-硫酸化，然后除去先前步骤中得到的化合物IIIa和IIIb中存在的O-酰基基团。

2.权利要求1的方法，其中步骤a)的软骨素钠盐是由大肠杆菌(E.coli)菌株O5:K4:H4培养液产生的荚膜多糖K4或者大肠杆菌(E.coli)菌株DSM23644培养液产生的多糖开始而得到的。

3.权利要求1的方法，其中步骤b)用原酸酯进行，所述原酸酯选自原乙酸三甲酯、原乙酸三乙酯、原甲酸三甲酯、原甲酸三乙酯、原丙酸三甲酯、原丙酸三乙酯或原苯甲酸三甲酯，优选原乙酸三甲酯或原乙酸三乙酯，更优选原乙酸三甲酯。

4.权利要求1的方法，其中步骤b)的酸催化用选自樟脑磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸的酸或者用砜树脂完成，优选用樟脑磺酸或者磺酸树脂，更优选用樟脑磺酸完成。

5.权利要求1的方法，其中步骤c)用乙酸酐进行。

6.权利要求1的方法，其中步骤d)在20-40℃、优选在室温进行。

7.权利要求1的方法，其中步骤d)在40-70℃、优选在60℃进行。

8.权利要求1的方法，其中步骤d)在水/水溶性有机酸混合物或者单独的水中进行。

9.权利要求8的方法，其中有机酸选自乙酸、甲酸、丙酸、酒石酸、柠檬酸或者丙酸树脂，优选乙酸或丙酸，更优选乙酸。

10.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐具有10-30kDa的平均分子量(Mw)。

11.权利要求10的方法，其中硫酸软骨素钠盐具有90/104S/6S至10/904S/6S比率的单硫酸盐基团分布。

12.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐中4-位和6-位硫酸化的N-乙酰基-D-半乳糖胺单元间的比率低于1。

13.权利要求1的方法，其中得到的硫酸软骨素钠盐中4-位和6-位硫酸化的N-乙酰基-D-半乳糖胺单元间的比率高于1。

14.硫酸软骨素钠盐，其根据权利要求1的方法得到。

15.生物技术来源的具有4000-9000道尔顿平均分子量的硫酸软骨素，其中在同一多糖链中的所有N-乙酰基-D-半乳糖胺单元被随机地或者在4-或6-位单硫酸化。

16.根据权利要求15所述的硫酸软骨素，其具有90/104S/6S至10/904S/6S比率的单硫酸盐基团分布。

17.权利要求14-16的硫酸软骨素用于预防和治疗骨关节炎和/或用于维持肌肉骨骼系统的健康的用途。