[发明专利]用于有机分子修饰的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于有机分子烷基化的方法。

发明背景

翻译后修饰(PTM)为用于调节蛋白功能的基本机制。日益认识到其重要性的一个此类PTM为蛋白赖氨酸(Lys)乙酰化。与酪氨酸(Tyr)/丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)磷酸化类似，Lys乙酰化为可逆的生化过程，其中赖氨酸乙酰转移酶将乙酰基添加至赖氨酸残基的ε氨基。脱乙酰酶以相反的方式起作用从而将它移除。最初在组蛋白中发现，最近也在许多其它的蛋白中观察到赖氨酸乙酰化，表明它在细胞中多样的调节功能。越来越多的证据表明异常的赖氨酸乙酰化与许多疾病状态有关，诸如癌症和神经系统病症。因此，赖氨酸乙酰化生物学的研究是非常重要的并且将引起连续的治疗创新。

尽管多年的深入研究已牢固地确定了赖氨酸乙酰化作为组蛋白遗传外标记在影响核染色质结构和功能中发挥了广泛的作用，大多数单独的乙酰化事件-特别是最近所鉴定的那些事件-的效应仍待阐明。遗传学、细胞生物学以及特别是蛋白组学中最近的研究已在大量非组蛋白蛋白中鉴定了赖氨酸乙酰化。这些修饰中大多数的功能是未知的。作为主要的限制因素，包含感兴趣的乙酰化的赖氨酸(“Lys-Ac”)残基的均质蛋白样品的缺乏经常阻碍了蛋白赖氨酸乙酰化的研究。此类均质乙酰化的蛋白为用于经由生物物理学和生物化学的方法辨别具体的Lys-Ac PTM的结构和功能效应的非常宝贵的试剂。

一些方法用于制备位点特异修饰的蛋白，诸如利用琥珀终止密码子/tRNA对抑制剂的非天然的氨基酸突变和蛋白化学合成，但是对这些方法广泛应用在整个生物科学研究领域而言，仍存在显著的技术壁垒。然而，非天然的氨基酸突变不是广泛地可用，因为它是专利技术；而蛋白化学合成需要训练有素的化学家的丰富的专业知识，并且在技术上非常有挑战性以及劳动密集型的。

另一个已知的方法是基于非天然的氨基酸突变和化学修饰的组合应用，从而产生乙酰基赖氨酸类似物但是修饰的氨基酸丢失了光学纯度。重组蛋白的酶促赖氨酸乙酰化好像是一有吸引力的方法。然而，考虑到赖氨酸乙酰基转移酶的混乱和不完整的酶促反应性质，如果不可能分离出来或表征期望的乙酰化产物的话，它难以用于结构和功能研究。

对其它确实提供了必要的特异性的酶促反应而言，它们经常必须在大的高分子复合物的情况下起作用，诸如借助于其它接合体分子，这使得它们几乎没有实际价值。

因此高度期望用于在重组蛋白中选择性装配乙酰化的Lys残基的化学方法。显然，在正常蛋白中许多可能的赖氨酸残基存在下，具体的赖氨酸残基的直接乙酰化在化学上是不可行的。

已经广泛地利用了作为软亲核试剂的半胱氨酸(Cys)的巯基的独特反应性用于选择性蛋白修饰。以前，研发化学方法用于将接近等量的N-甲基-赖氨酸的类似物装配在重组蛋白上(参见下文的方案I)。方法基于Cys残基的巯基与溴化氨乙基或氯化氨乙基的传统的烷基化反应，这产生了氨乙基半胱氨酸，其为已知的赖氨酸等价物。

当烷化剂更改为N-甲基氨乙基卤化物时，产生了N-甲基化的氨乙基半胱氨酸残基或N-甲基硫代Lys(“硫醛Lys(Me)”)，其已经显示了与天然的Lys(Me)功能性相似。

方案I

同样地，提出相似的策略以通过利用半胱氨酸巯基的独特的反应性制备天然的Lys(Ac)残基的近似模拟物。然而，使Cys巯基与相似的N-乙酰基-氨乙基溴化物和N-乙酰基-氮杂环丙烷烷基化的尝试未能产生期望的产物(参见方案IIa)。

在现有技术下进一步的努力引起甲基硫代羰基-氮杂环丙烷作为烷化剂的发展，从而提供作为N-乙酰基-Lys模拟物的甲基硫代羰基-硫代Lys(参见方案IIb)。尽管烷基化反应是成功的而且合成的甲基硫代羰基-硫代Lys被证明是公认的含有溴结构域的蛋白和抗-乙酰基-Lys抗体，在硫代氨基甲酸酯部分中羰基和甲基之间大的硫原子的存在使得它只是Lys(Ac)中乙酰胺部分的远亲类似物。从空间位阻和电化学的观点来看，乙酰基和甲基硫代羰基之间存在着明显的相当大的差异(参见方案IIb中的结构)，这可以解释了为什么硫代氨基甲酸酯修饰对组蛋白脱乙酰酶裂解有抵抗力。

方案II