[发明专利]免疫刺激性寡脱氧核苷酸

说明书

本发明涉及免疫刺激性寡脱氧核苷酸、包含此寡脱氧核苷酸的载体和疫苗、它们作为药物的用途、它们在预防或抵御传染病中的用途、以及用于检测此寡脱氧核苷酸的方法。

在过去20年中，免疫科学中已经发现，脊椎动物的免疫系统具有通过受体介导识别病原体的独特特征而检测微生物感染并触发快速免疫活化的机制，即所谓与同源宿主病原体识别受体(PRR)相互作用的病原体相关分子模式(PAMP) (Iwasaki A, Medzhitov R. 2001. Science 327, 291-295；Medzhitov R., 2009. Immunity 30, 766-775)。

现在清楚某些形式的病原体脱氧核糖核酸(DNA)在这些PAMP之中。在1995年，报道称，细菌DNA中的非甲基化CpG基序触发鼠B细胞活化(Krieg 等，1995)。此研究首次形成了细菌的含免疫刺激性非甲基化CpG的DNA的特异性识别与此前认识到的CpG抑制以及哺乳动物DNA中普遍的CpG甲基化之间的关联。证明最有效的B细胞刺激性非甲基化CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)具有序列元件GACGTT。

本领域中接下来的里程碑式的论文由日本大阪的Shizuo Akira实验室发表(Hemmi 等，2000)。通过小鼠中的基因克隆和靶向基因敲除方法，能够明确地显示小鼠中对CpG-ODN的细胞应答由toll样受体9(TLR9)介导。随后，证明CpG-ODN是主要通过NFκ-B途径的TLR9信号转导的激动剂(Medzhitov 2001)。在随后的十年中，已经发表了相当大量关于基础研究课题以及关于常规的潜在免疫治疗应用的研究(例如综述于Krieg 2002、2003、2006；Klinman 2004；Vollmer 2005；Wilson等，2006；Kindrachuk等，2008；Dorn和Kippenberger 2008；Vollmer和Krieg 2009；Wilson等，2009)。很多综述文章集中在CpG-ODN的抗感染应用(Krieg 2007)、TLR9激动剂在癌症治疗中的应用(Krieg 2007；Weiner 2009)、TLR9活化用于哮喘和变态反应治疗(Kline 2007；Kline和Krieg 2008；Fonseca和Kline 2009)，以及作为疫苗佐剂(Klinman等，2004；Klinman 2006；Daubenberger 2007；Wagner 2009；Mutwiri等，2009；Klinman等，2009)中的应用。

还已经描述并讨论了CpG ODN作为兽医应用中的免疫刺激剂和疫苗佐剂，特别是在牛、猪、绵羊、狗、鸡和鱼中(Babiuk等，2003；Carrington和Secombes 2006；Griebel等，2005；Mutwiri等，2003；Singh和O’Hagan 2003；Werling和Jungi 2003)。

在鸡中的兽医用途领域中，已描述了在例如疫苗中的CpG寡脱氧核苷酸，用于保护鸡以抵抗新城疫的用途(Linghua 2007)。

近期显示，在鸡中，TLR21在CpG寡脱氧核苷酸的识别中发挥哺乳动物TLR9的功能同源物的作用(Brownlie等，2009)。

迄今为止，作为免疫调节剂的特异性CpG ODN的设计相当随机。对于非哺乳动物CpG ODN尤其如此。其原因是多因素的；首先没有关于用于人类TLR的免疫调节CpG基序与用于非人类(更不用说非哺乳动物物种)中的TLR的免疫调节CpG基序之间的相关性的知识。其次，没有可用的具有足够低的背景噪音比水平的细胞系统，以选择性地测试非常低浓度的CpG ODN的作用。此外，没有可用的高通量筛选方法，并且即便有，CpG ODN作为在非哺乳动物物种中的免疫调节剂的体内与体外功效之间也没有清楚的相关性。

因此，显然需要具有高免疫调节作用并且因此在低剂量下有效的新CpG ODN。并且，还需要选择性且灵敏的CpG ODN选择系统，用于显示CpG-活性的体外和体内活性之间的相关性的兽医目的。

本发明的目的之一是提供这样的新CpG ODN。

在此方面，本发明的一个实施方式涉及具有以下通式的免疫刺激性非甲基化寡脱氧核苷酸，及其药学可接受的盐：

其中，n = 2-100，x = 3-20且z = 0-10。