[发明专利]丝状真菌中多个基因拷贝的同时位点特异性整合

权利要求书

1.一种用于将两个或更多个拷贝的目标多核苷酸同时整合到真菌宿主细胞的染色体中的方法，所述方法包括以下步骤：

（a）提供在其染色体内包括至少两个整合位点的真菌宿主细胞，每个整合位点包括一对位点特异性重组酶的识别序列，每对识别序列位于驻留阴性选择标记的两侧；

（b）向所述细胞中引入核酸构建体，所述核酸构建体包括一对所述位点特异性重组酶的识别序列，所述识别序列对位于所述目标多核苷酸的两侧；

（c）在所述细胞中短暂表达所述位点特异性重组酶，借此染色体的识别序列对通过所述重组酶与所述核酸构建体的对应的识别序列对重组，从而使得在所述至少两个整合位点，所述染色体中的驻留阴性选择标记被切除而所述目标多核苷酸的拷贝整合到它的位置上，产生包括两个或更多个拷贝的整合到所述真菌宿主细胞的染色体中的所述目标多核苷酸的真菌宿主细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在选择性培养基中培养步骤（c）中的真菌宿主细胞并选择其中真菌宿主细胞包括至少两个整合到所述真菌宿主细胞的染色体中的目标多核苷酸的细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标多核苷酸包括编码至少一个目标多肽的操纵子或开放阅读框。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述目标多肽包括酶，优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞；优选为支顶孢属（Acremonium）、曲霉属（Aspergillus）、短梗霉属（Aureobasidium）、烟管菌属（Bjerkandera）、拟蜡菌属（Ceriporiopsis）、金孢子菌属（Chrysosporium）、鬼伞属（Coprinus）、革盖菌属（Coriolus）、隐球菌属（Cryptococcus）、Filibasidium、镰孢霉属（Fusarium）、腐质霉属（Humicola）、稻瘟菌属（Magnaporthe）、毛霉属（Mucor）、毁丝霉属（Myceliophthora）、Neocallimastix、脉孢菌属（Neurospora）、拟青霉属（Paecilomyces）、青霉属（Penicillium）、平革菌属（Phanerochaete）、射脉菌属（Phlebia）、Piromyces、侧耳属（Pleurotus）、裂褶菌属（Schizophyllum）、踝节菌属（Talaromyces）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）、梭孢壳属（Thielavia）、弯颈霉属（Tolypocladium）、栓菌属（Trametes）或木霉属（Trichoderma）细胞，或者更优选为泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、臭曲霉（Aspergillus foetidus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、日本曲霉（Aspergillus japonicus）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、烟管菌（Bjerkandera adusta）、干拟蜡菌（Ceriporiopsis aneirina）、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟蜡孔菌（Ceriporiopsis gilvescens）、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispora）、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌（Chrysosporium keratinophilum）、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌（Chrysosporium tropicum）、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞（Coprinus cinereus）、毛云芝菌（Coriolus hirsutus）、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）、禾赤镰孢（Fusarium graminum）、异孢镰孢（Fusarium heterosporum）、Fusarium negundi、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、Fusarium reticulatum、粉红色镰刀菌（Fusarium roseum）、接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）、肤色镰孢（Fusarium sarcochroum）、拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）、硫色镰刀菌（Fusarium sulphureum）、Fusarium torulosum、拟丝孢镰刀菌（Fusarium trichothecioides）、Fusarium venenatum、特异腐质霉（Humicola insolens）、柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa）、米赫毛霉（Mucor miehei）、嗜热毁丝菌（Myceliophthora thermophila）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、产紫青霉（Penicillium purpurogenum）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、脉射侧菌（Phlebia radiata）、白腐菌（Pleurotus eryngii）、太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、长绒毛栓菌（Trametes villosa）、变色栓菌（Trametes versicolor）、哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）、康宁木霉（Trichoderma koningii）、长梗木霉（Trichoderma longibrachiatum）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、或绿色木霉（Trichoderma viride）细胞。