[发明专利]用于蛋白质的质谱分析法的定量标准

说明书

技术领域

本发明涉及测定样品中靶多肽的绝对量的方法，该方法包括以下步骤：（a）向该样品中加入（aa）融合多肽，该融合多肽包含（i）至少一个标签(tag)序列和（ii）靶多肽的子序列；并向该样品中加入（ab）已知绝对量的标签多肽，所述标签多肽包含根据（aa）的标签序列或由根据（aa）的标签序列组成，其中所述融合多肽（作为一方），与所述靶多肽和所述标签多肽（作为另一方）相比，是质量改变的，例如，融合多肽（作为一方）与所述靶多肽和所述标签多肽（作为另一方）相比是不同同位素标记的；（b）对步骤（a）中获得的混合物进行蛋白水解消化；（c）对步骤（b）的蛋白水解消化的产物，可选地在层析之后，进行质谱分析；及（d）从(i)步骤（c）获得的质谱中所述融合多肽、所述标签多肽和所述靶多肽的峰强度及（ii）所述标签多肽的该已知绝对量，确定所述靶多肽的绝对量。

在本说明书中，引用了多份文献，包括专利申请和厂家手册。这些文献的公开内容不认为与本发明的专利性相关，但这些文献的公开内容在此以其整体引入作为参考。更具体而言，所有参考的文献引入作为参考，其引用程度就如同明确地和单独地指出每一单个文献引入作为参考一样。

背景技术

基于质谱分析法（MS）的蛋白质组学已成为以整体方式研究蛋白质的优选方法（1-3）。质谱分析法本身并不具有定量性，但已发展了方法来在某种程度上克服此局限性。这些方法中的大多数基于稳定的同位素，并引入目的肽的质量迁移形式，然后通过它们的“重”/“轻”比率来进行定量。可以通过标记试剂的化学加入、酶促同位素标记或代谢标记来达到稳定同位素标记（4-6）。通常，这些方法用于在轻标记和重标记的样品中获得有关蛋白质组表达水平的相对定量信息。例如，在细胞培养中利用氨基酸进行的稳定同位素标记——SILAC——通过将不同标记的（如轻标记或重标记）的氨基酸掺入蛋白质组中来实施（7,8）。经标记的蛋白质组还可以用作内部标准，以确定目的细胞或组织蛋白质组的蛋白质水平，如在掺入（spike-in）SILAC法中（9）。

绝对定量在技术上比相对定量更具挑战性，迄今一次仅可对单种或少数几种蛋白质进行准确地绝对定量（10）。绝对定量的典型应用是测定细胞的蛋白质拷贝数（对系统生物学重要）或体液中生物标记的浓度（对医学应用重要）。此外，在一个以上样品中进行时，任何精确的绝对定量方法都可以在这些样品之间产生蛋白质的相对量。

过去几年中出现了几种用于绝对定量的方法，包括AQUA（11）、QConCAT（12,13）、PSAQ（14）、绝对SILAC（15）和FlexiQuant（16）。它们全都通过相对于掺入样品中的确定量的标记对应物、基于重轻比来定量内源目的蛋白质，相互间的区别主要在于是掺入重标记的肽还是重标记的全长蛋白质。AQUA策略使用蛋白典型（proteotypic）肽（17），其用重同位素化学合成并在样品制备后掺入。AQUA肽可购得但昂贵，尤其是在需要定量许多肽或蛋白质时（见例如Kettenbach等,Nat Protoc.2011,6:175-86）。此外，AQUA策略受定量不确定性的困扰，该定量不确定性是由于在样品制备和酶促蛋白水解后（即，流程的后期）掺入肽标准而引入的。此外，肽的任何丢失（例如在保存期间）都将直接影响定量结果。QconCAT方法基于人工蛋白质，该人工蛋白质是蛋白典型肽的多联体。此人工蛋白质在大肠杆菌（Escherichia coli）中重组表达，并在蛋白水解前掺入样品。QconCAT允许产生标记的肽，但不校正源自蛋白质分级分离效应或消化效率的任何偏差。PSAQ、绝对SILAC和FlexiQuant法试图通过用重形式的氨基酸——精氨酸和赖氨酸——代谢标记全长蛋白质来克服这些局限性。PSAQ和FlexiQuant分别在小麦胚芽提取物中或在细菌细胞提取物中体外合成全长蛋白质，而绝对SILAC描述为在大肠杆菌中的重组蛋白质表达。该蛋白质标准在早期，如直接向细胞裂解物中，加入。随后，可以平行进行样品分级分离，并且SILAC蛋白质与所研究的蛋白质组一起消化。但是，这些优势以必须产生全长蛋白质为代价，这限制了通量，且通常将这些方法限于可溶性蛋白质。

因此，尚需要改进的或备选的基于质谱分析法的肽和多肽绝对定量手段和方法。

发明内容